大鼠嗅鞘细胞免疫抗原分子检测*

梅爱农,王珏,杨心青,程琼,雷慧新,杨津,朱鹏立

福建省立医院 a.干部特诊一科,b.儿科,c.耳鼻喉科,d.神经内科,福州 350001

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)具有成鞘和促进轴突再生作用,在以脱髓鞘为主要病理改变的自身免疫性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)及多发性硬化(multiple sclerosis,MS)的治疗中有一定应用价值。目前国内外对有关OECs的免疫原性及移植免疫的研究几乎空白,本实验首次检测OECs的主要组织相容性抗原(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)分子及髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、髓鞘含脂质蛋白(myelin proteolipid protein,PLP)、髓鞘结合糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)等鞘膜抗原蛋白的表达情况,为OECs移植后可能面临的免疫反应提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:新生1～2 d健康 Wistar大鼠,由福建省立医院动物实验中心提供。②主要试剂与材料:胎牛血清(购于杭州四季青公司),DMEM/F12培养基(购于 GIBCO公司),鼠抗NGFRp75(购于武汉博士德公司),兔抗MBP和兔抗MAG(购于上海晶天公司),兔抗PLP(购于Abcam公司),荧光素异硫氰酸酯标记抗 MHC-I(FITC-anti-MHC-I)和荧光素异硫氰酸酯标记抗MHC-II(FITC-anti-MHC-II)(购于BD Pharmingen公司),流式细胞仪(购于Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 OECs的培养 取新生1～2 d健康Wistar大鼠嗅球加入 0.125%胰酶2 mL于37℃消化15 min,移入离心管,吹打成OECs单细胞悬液,1200 r/min离心6 min,弃上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基,调节细胞密度为 1×106/mL,接种于玻璃培养瓶(未包被),37℃、5%CO2培养箱中培养18 h后,将细胞悬液转移至另一玻璃培养瓶(未包被)继续培养24 h后转移至塑料培养瓶(多聚右旋赖氨酸包被),根据细胞生长情况每2～3 d半量换液,细胞长满瓶底后传代,镜下观察细胞形态及生长情况。

1.2.2 OECs鉴定及 MBP、MAG、PLP分子检测

OECs细胞爬片经漂洗、4%多聚甲醛室温固定后,5%Triton室温作用30 min,正常羊血清室温封闭20 min,不同爬片分别加适量NGFRp75、MBP、MAG及PLP一抗4℃孵育过夜,加生物素化二抗,37℃孵育20 min,加过氧化物酶标记的链霉卵白素,37℃孵育15 min,以上各步骤结束时均须PBS冲洗3次,DAB显色,PBS冲洗终止反应,常规脱水、透明、封片、镜下观察并照相。每张爬片随机计数10个非重叠视野(×200),分别计数阳性细胞数和细胞总数,计算阳性细胞比例。

1.2.3 OECs体外培养细胞MHC-I与MHC-II的表达 收集OECs,制备单细胞悬液,调整细胞密度至 5×106/mL,取 4 管 ,每管 50 μ L,加入1 ∶20 灭活正常兔血清,4℃封闭30 min,取其中2管分别加入FITC-anti-MHC-I和 FITC-anti-MHC-II各10 μ L,另外2管不加抗体作相应对照,4℃避光孵育30 min,PBS洗2次,流式细胞仪检测,EXPO32TM ADC软件进行数据处理。

2 结果

OECs在接种时细胞呈圆形,折光性好,6 h后开始贴壁生长;3 d时细胞以梭形为主,胞体发亮,两端发出纤细突起,见图1A;5～6 d时大部分细胞呈双极或三极,其特征为细长的突起,见图1B;9～10 d时细胞长满瓶底,排列方向不一,细胞间相互交联。免疫细胞化学检测显示,87%细胞NGFRp75阳性,为OECs细胞,见图1C。流式细胞仪检测结果显示,体外培养的OECs表面高表达MHC-I分子(78.4±4.45)%,中等表达 MHC-II分子(43.2±2.98)%,见图2A-B。免疫细胞化学检测显示,OECs细胞上未见 MBP、MAG、PLP分子表达,见图3A-C。

3 讨论

细胞的免疫原性主要取决于其表面MHC分子的表达情况。细胞移植时,受者的免疫细胞如抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)、CD4+Th1(T helper,Th)及CD8+TCL(T cell lines,TCL)细胞能直接或间接识别移植细胞表面的MHC-II、MHC-I类分子[1]。CD8+TCL细胞能结合MHC-I类分子,启动细胞毒性作用导致移植细胞死亡,CD4+Th1细胞能结合MHC-II类分子,活化的Th细胞分泌细胞因子如白细胞介素-2、干扰素-γ及淋巴毒素,促进细胞毒T细胞的发育成熟,通过迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)及抗体依赖的细胞毒效应(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)介导移植排斥反应[1]。此外,MHC分子尚能直接导致吞噬细胞的吞噬和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)穿孔素杀伤。本实验发现,来源于嗅球的OECs高表达MHC-I类分子,中等表达 MHC-II类分子,一旦这种细胞异体或异种移植,高表达的MHC-I类分子能被受者的CD8+TCL以及非特异免疫细胞如NK细胞、巨噬细胞直接识别,导致细胞死亡;同时存在的MHC-II类分子可能激发受者CD4+Th1细胞介导的DTH,导致排斥反应的最大化和慢性排斥,这可能是目前异体或异种OECs移植效果不尽人意的原因之一。

自体OECs的培养成功[2]给OECs自体移植带来希望。这种移植用于诸如脊髓损伤的治疗时,无需考虑移植排斥问题,但如果用于MS等这类自身免疫性脱髓鞘疾病的治疗,同样存在自身免疫排斥的问题。MS发病的分子模拟学说认为,某些病毒蛋白的抗原决定簇(表位)和中枢神经系统的髓鞘抗原相类似,病毒抗原可以激活反应性T细胞诱发特异性免疫应答,不仅能与病毒抗原反应,也可产生针对自身组织-髓鞘抗原的交叉免疫反应。在EAE模型中,给易感动物皮下注射髓鞘蛋白成分,如MBP、PLP135-151、MOG35-55伴完全弗氏佐剂,可诱发与MS相似的CD4+Th1细胞介导的自身免疫性脱髓鞘病[3]。因此,移植细胞是否表达MBP、PLP、MOG等髓鞘蛋白是MS等疾病移植治疗成功的关键。本实验发现,来源于嗅球的OECs表面并不表达MBP、MAG、PLP等重要的髓鞘蛋白。目前国内外有关这方面的研究极少,个别研究指出,OECs与脊髓背根神经节神经元或嗅球组织混合培养,OECs会联络神经元并合成鞘磷脂如MBP,但单独培养条件下或提高培养基中cAMP浓度,均不能诱导OECs的MBP合成[4],提示这种具有成鞘潜力的细胞似乎处于一种不成熟的状态,仅当其在一定的培养环境尤其是与神经元取得联系后才会启动相关基因,促进髓鞘蛋白乃至髓鞘的合成。对少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)移植鼠脱髓鞘模型的研究提示,仅当处于炎性环境下,OPCs才能与受损神经元的轴突取得联系,此过程通常以0.2 mm/周的速度自脱髓鞘周边向中心区迁徙[5]。假设OECs以同样方式迁徙,首先其仅会与炎性区神经元获得联络,因而避免在迁徙过程中受到免疫攻击,其次因为迁徙过程极度缓慢,OECs也在相当长时间内因为缺乏MBP等重要髓鞘蛋白而免受自身反应性淋巴细胞的攻击,从而相对“免疫赦免”,提示OECs在移植之初不大可能受到自身免疫系统的攻击。

总之,尽管OECs由于存在一定程度的MHC分子表达,在异种或同种异体移植中可能面临一定程度的免疫排斥,但由于其缺乏髓鞘相关蛋白如MBP、PLP、MAG等,在自体移植治疗包括脊髓损伤(甚至自身免疫性疾病如MS)等疾病中有一定的应用前景。

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