电刺激小脑顶核对局灶性脑缺血大鼠脑组织核因子-κ B、基质金属蛋白酶-9表达的影响

龚家明,罗勇,蒋开夫,刘毅

1.安康市中心医院神经内科,陕西 安康725000;2.重庆医科大学第一附属医院神经内科,重庆400016

电刺激小脑顶核(fastigial nucleus stimulation,FNS)对局灶性脑缺血再灌注后神经损伤有保护作用,其机制尚未完全阐明[1,2]。核因子-κ B(nuclear factor kappa-B,NF-κ B)是重要的核转录因子,激活后可诱导多种下游靶基因表达,基质金属蛋白酶(matrix metallproteinases,MMP-9)是其中重要的一种。MMP-9可攻击和破坏血-脑脊液屏障,导致脑卒中后血管源性脑水肿,并对神经元有一定毒性。本实验通过观察FNS对局灶性脑缺血再灌注后大鼠脑组织NF-κ B和MMP-9 mRNA转录及蛋白表达的影响,探讨FNS的中枢神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:健康雄性Wistar大鼠40只,体质量250～300 g,由重庆医科大学实验动物中心提供。②主要试剂与材料:羊抗大鼠NF-κ B/P65和MMP-9单克隆抗体、免疫组化试剂盒(购于北京中杉生物公司);双极同心圆电极(直径100 μ m,重庆医科大学生理学教研室提供);引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 缺血再灌注模型制备及分组 所有大鼠随机分为正常对照(normal control,NC)组、缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)组、电刺激小脑齿状核(dentate nucleus stimulation,DNS)组和FNS组各10只。NC组不予任何处理,其余3组制作局灶性脑缺血再灌注模型(缺血2 h后再灌注24 h)[3]。术中出血较多、呼吸困难、取脑时发现蛛网膜下腔出血及提前死亡者剔除,并补足相应例数。动物苏醒后参考Longa等[4]的评分法评分,2分或2分以上者入选本实验。

1.2.2 DNS和FNS 3.5%水合氯醛1 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠后固定于脑立体定向仪上,沿颅骨中线剪开头皮,暴露前囟,根据大鼠脑立体定位图谱进行核团定位。小脑齿状核定位于前囟后11.6 mm,左旁开 3.0 mm,深度6.5 mm;小脑顶核定位于前囟后11.6 mm,左旁开1.1 mm,深度5.6 mm。钻开颅骨后,插入双极同心圆电极,予强度 50 μ A 、频 率 70 Hz、时程 0.5 ms 的电刺激 。DNS组再灌注同时DNS 1 h;FNS组再灌注同时FNS 1 h。在电刺激过程中维持动物始终处于浅麻醉状态。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测NF-κ B/P65和MMP-9 mRNA转录水平 再灌注24 h后,提取各组大鼠脑组织总RNA并定量,DNAase I处理总RNA去除DNA污染后,各实验组取等量RNA逆转录后进行PCR。NF-κ B/P65引物正义链:5'-TGCACCTAGCTGCCAAAGAAGGA-3',反义链:5'-TCTGCTCCTGCTGCTT TGAGAA-3',产物长度293 bp。内参β-actin引物正义链:5'-TCACCATCTTCCAGGAGGGA-3',反 义 链:5'-CACAATGCCGAAGTCGTCGT-3',产物长度376 bp。MMP-9引物正义链:5'-AGGCTACAGCTTTGCTGCCCC-3',反义链:5'-GCTGCTTCTGAAGCATCAGCA-3',产物长度194 bp。内参β-actin引物正义链:5'-CTGGTGGACAACATCGCTCT-3',反义链:5'-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3',产物长度349 bp。PCR反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,58℃复性30 s,72℃延伸1 min,循环35次;72℃延伸7 min;4℃终止反应。取PCR扩增产物5 μ L行琼脂糖凝胶(20 g/L)电泳,电压80 V,紫外灯下观察电泳结果并照相。Quantity One-4.4.0软件行半定量分析,以目的基因与β-actin条带平均光密度比值表示目的基因mRNA的相对转录水平。

1.2.4 免疫组织化学法检测 NF-κ B/P65和MMP-9蛋白表达 再灌注24 h后,4%多聚甲醛灌注固定大鼠,断头取脑。冠状切取视交叉后部脑组织,常规梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片脱蜡、水化,30 g/L H2O2室温10 min灭活内源性酶,蒸镏水洗涤3次,滴加正常血清封闭液,室温孵育20 min,不同切片分别滴加适量 NF-κ B/P65和MMP-9抗体,4℃湿盒孵育过夜。滴加生物素化二抗,37℃孵育20 min,滴加链霉亲合素-生物素-过氧化氢酶复合物37℃孵育20 min。DAB显色,常规脱水、透明、封片。每只大鼠取三张切片,400×放大倍数下,每张切片随机取5个视野,Image-pro plus 5.0图像分析软件测定计算平均光密度值(optical density,OD)。

1.3 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件处理数据,计量资料以(±s)表示,方差齐性资料采用F检验,方差非齐性资料采用秩和检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测结果 与NC组相比,I/R组、DNS组和 FNS组 NF-κ B/P65及 MMP-9 mRNA转录水平均增高(P＜0.05),FNS组 NF-κ B/P65及MMP-9 mRNA转录水平较I/R和DNS组降低(P＜0.05),DNS组与 I/R 组比较 NF-κ B/P65及MMP-9 mRNA转录水平无显著性差异,见图1、图2及表 1。

2.2 免疫组织化学检测结果 NF-κ B/P65阳性细胞胞浆黄染,NC组可见少量NF-κ B/P65阳性细胞;I/R组和DNS组NF-κ B/P65阳性细胞较NC组增多(P＜0.05),且胞浆、胞核均黄染;FNS组NF-κ B/P65阳性细胞较I/R组和DNS组减少(P＜0.05);I/R组和DNS组比较差异无统计学意义。MMP-9阳性细胞胞浆黄染,NC组可见少量MMP-9阳性细胞;I/R组和DNS组MMP-9阳性细胞较NC组增多,呈强阳性表达(P＜0.05);FNS组MMP-9阳性细胞较 I/R组和 DNS组减少(P＜0.05);I/R组和DNS组比较差异无统计学意义,见图3A-D、图4A-D及表2。

表1 各组大鼠NF-κ B/P65及MMP-9 mRNA转录水平比较(±s)

表1 各组大鼠NF-κ B/P65及MMP-9 mRNA转录水平比较(±s)

与NC组比较,①P＜0.05;与FNS组比较,②P＜0.05

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表2 各组大鼠的NF-κ B/P65、MM P-9蛋白表达平均OD值比较(±s)

表2 各组大鼠的NF-κ B/P65、MM P-9蛋白表达平均OD值比较(±s)

与NC组比较,①P＜0.05;与FNS组比较,②P＜0.05

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3 讨论

NF-κ B属于Rel蛋白家族成员,可组成同源或异源二聚体,是重要的转录调节因子。静息状态下,NF-κ B处于失活状态,在胞浆内与NF-κ B抑制因子(inhibitor of factor kappa B,Iκ B)结合,被激活后与Iκ B解离,转入核内与特定DNA序列结合,调节相关基因转录。脑缺血再灌注后,NF-κ B被氧自由基、细胞因子、钙超载等因素刺激活化后诱导细胞因子、粘附分子、炎性酶类、凋亡基因的表达,促进氧自由基形成,加重钙超载,造成脑缺血损伤[5]。

MMP-9是基质金属蛋白酶家族成员之一,主要作用于血管基底膜成份,可降解血管周围基膜主要成份IV型明胶胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白等,与脑缺血后血-脑脊液屏障的破坏密切相关。MMP-9是NF-κ B的下游靶基因之一,脑缺血后,活化的NF-κ B进入核内启动MMP-9的mRNA转录,MMP-9蛋白合成明显增加,通过蛋白水解作用破坏毛细血管紧密连接和基底膜,导致血-脑脊液屏障崩溃,加重脑水肿,加快炎性细胞浸润及神经细胞死亡,加重缺血性脑损伤[6-8]。Rosenberg等[9]发现,大鼠大脑中动脉闭塞 2 h后,MMP-9表达增高,24 h达高峰,持续 5 d,与脑水肿的发生、发展时间规律一致。本实验显示,缺血再灌注后24 h,NF-κ B和MMP-9的mRNA转录及蛋白表达增加。

研究显示,FNS可增加局部脑血流,减轻兴奋性神经毒性作用,保护神经组织,减轻脑水肿,促进神经功能恢复。本实验结果显示,FNS可下调脑缺血再灌注后NF-κ B和MMP-9的mRNA转录及蛋白表达,DNS对脑缺血再灌注后NF-κ B、MMP-9表达水平无明显作用,提示FNS可能通过抑制NF-κ B激活和减少其表达,下调其下游MMP-9的表达,减轻脑缺血后血-脑脊液屏障的破坏和脑水肿,发挥神经保护作用。

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[9]Rosenberg GA,Estrada EY,Dencoff JE.Matrix Metalloproteinases and TIM Ps Are Associated with Bloodbrain Barrier Opening after Reperfusion in Rat Brain[J].Stork(S0039-2499),1998,29(10):2189-2195.