局灶性脑缺血动物模型的制备*

马宁,蔡继福,姜卫剑首都医科大学附属北京天坛医院急诊介入科,北京 100050

局灶性脑缺血动物模型的制备*

马宁,蔡继福,姜卫剑#首都医科大学附属北京天坛医院急诊介入科,北京 100050

局灶性脑缺血;动物模型;制备

#【通讯作者】姜卫剑,Tel:86-10-67096611,E-m ail:cjr.jiangweijian@vip.163.com。

在中国,脑血管病的发病率和病死率呈逐年上升趋势,给患者、家庭和社会造成巨大的负担。临床上脑血管病分为缺血性脑血管病和出血性脑血管病,其中以缺血性脑血管病多见。选择合适的脑血管病动物模型,对于研究脑血管病发病机制、病理生理、诊断及防治等有重要意义。本文对局灶性脑缺血动物模型综述如下。

1 局灶性脑缺血动物模型的要求

国际脑血管病委员会于1984年对局灶性脑缺血动物模型提出明确要求[1],对手术方式的要求为:尽量减小手术对脑的损害,避免颅内组织暴露于空气,避免颅内环境稳定性遭到破坏。对模型设计的要求为:单根血管可反复阻塞;该血管引起的改变可从血流改变等方面进行观察;巴比妥类药物在血管阻塞期间避免反复使用,以利于神经功能障碍的观察;实验对脑实质造成的病变应与人类病理改变相似;血流阻断后可使血管再通,以恢复对缺血区的再灌注。

2 动物种类的选择

2.1 大动物 以大动物(如猴、猪、狗、猫)为模型研究脑缺血的优点:①虽然近年来某些影像学技术已可用于啮齿类小动物[2,3],但大多数影像学技术,如核磁共振、功能影像检测等更易用于大动物;②对大动物更易进行复杂的生理学监测(如诱发电位监测、脑电图监测、动脉血气分析、血压、血糖、乳酸和血红蛋白测定),这些指标可在同一动物多点同时测量,并可与该动物的神经系统表现、神经生化、神经病理学表现等进行相互比较;③大动物更适合用于测量脑血流量和研究脑代谢;④大动物有脑回,使之在结构和功能上与人类更相似。以大动物为模型研究脑缺血的缺点:因监测的方法通常为有创性,导致大动物缺血模型的死亡率较高;大动物费用高、饲养条件严格;不易判断梗死是否完全,梗死灶变化较大;大动物需要不同的麻醉方式,可能对梗死灶产生影响。

2.2 小动物 以小动物为模型研究脑缺血的优点:①小动物(特别是啮齿类动物)购买、饲养的费用较大动物明显降低;②小动物(特别是小鼠)在遗传上同质,通过基因修饰可相对容易地得到多种不同特性的转基因动物;③大、小鼠均有神经损伤程度的评价标准;④小动物脑体积小,可用某些特殊的固定技术对其进行固定[4]。以小动物为模型研究脑缺血的缺点:小动物缺乏脑回,在结构和功能上与人类有差异;难以进行生理学指标的监测。

3 常用局灶性脑缺血动物模型

脑缺血模型分为全脑缺血与局灶性缺血,全脑缺血指全部或大部分脑的脑血流量降低,局灶性缺血指某个特定脑区的脑血流量降低。常用局灶性脑缺血模型制作方法有线栓法、开颅机械闭塞法、光化学诱导血栓形成法、血凝块栓塞模型等。大多数局灶性脑缺血模型都是阻断小动物[4-6]或大动物[7-9]某条主要脑血管,如大脑中动脉闭塞(m idd le cerebral artery occlusion,MCAO)模型。大脑中动脉阻断,导致纹状体和大脑皮质脑血流量持续减少,但血流减少的程度和分布与阻断持续的时间、阻断部位及大脑中动脉供血区侧支血流的总量有关。目前广泛应用的MCAO模型有数种,多是永久或临时阻断大脑中动脉的近端或远端。

3.1 线栓法 线栓法自上世纪80年代后期即开始被广泛应用于细胞损伤及神经保护机制的研究[10,11]。该方法通过向大鼠颈内动脉插入一段型号为4-0的尼龙缝线至大脑中动脉远端,阻断大脑中动脉;线栓的插入长度一般为从颈动脉分叉处起17～20 mm,以阻断来自前交通动脉的侧支循环;将激光多普勒流速探头置于预定梗死区域,可方便地观察大脑中动脉阻断后脑血流量的下降。Belayev等[12]将线栓以聚左旋赖氨酸包被,使其更紧密地黏附血管内皮细胞,得到大小更稳定的梗死灶。通过这种技术,研究者观察到大脑中动脉阻断后,皮质、尾状核及壳核的脑血流量减少80%,并维持于该水平[13]。抽出线栓可实现脑血流再灌注,术后动物可存活数天至数月,以便测量并记录动物神经功能的变化[14]。线栓法在国内较常用。

3.2 开颅机械闭塞法 Tamura等[15]采用颞下颅骨切开术,并永久阻断大鼠大脑中动脉近端血流的方法制作局灶性脑缺血模型,该模型导致大鼠大脑皮质、尾状核及壳核梗死。

该方法可视性强,但损伤大,破坏颅腔完整性,并影响动物进食功能。Bederson等[16]对该方法进行改进,并证实大脑中动脉阻断的具体位置和程度可影响动物的神经功能及神经病理学表现。通过永久阻断大脑中动脉模型发现,组织学异常的大脑皮质区域局部脑血流量约为25 m L/(100g◦min),且缺血性损害的区域和脑血流量下降明显的区域相吻合[17]。Duverger等[18]对比不同品系(W istar、SD、Fischer-344、SHRs及SHRSPs)大鼠永久性MCAO模型发现,SHRs和SHRSPs大鼠的大脑半球梗死体积约为Wistar大鼠的1.5倍;SD大鼠的脑梗死体积也较大,但相对不稳定;在血压正常的品系中,Fischer-344大鼠的脑梗死体积最大且最稳定。有学者用电凝大脑中动脉的方法制作脑缺血模型,这种模型脑血流量下降的程度和神经病理损伤的程度高度对应。

3.3 光化学法诱导血栓形成 有学者用光化学法制作MCAO模型,即给动物腹腔注射四氯四碘荧光素等光敏物质后,采用蓝色氩染料激光透过颅骨照射大脑中动脉远端分支,二者在血管内发生光化学反应,产生大量活性氧,损伤血管内皮细胞,引起血小板黏附、聚集,血栓形成,造成额顶叶皮质梗死,很少累及深层结构。该模型的缺点为光化学反应会造成微血管损伤。与Wistar大鼠相比,SD大鼠脑梗死灶较大且较一致。

3.4 血凝块栓塞模型 此方法是通过颈外动脉逆行插管,将同种动物血凝块直接注入颈总动脉。该模型造模过程相对简单,最大缺点是梗死灶部位不一致。

4 其它局灶性脑缺血动物模型

4.1 再灌注模型 Shigeno等[19]使用圈套器节扎大脑中动脉或松解圈套器以达到阻断血流及再灌注目的。此方法可用以研究细胞再灌注损伤,但对技术要求较高,常用于猫及灵长类动物的研究。

4.2 转基因和基因敲除鼠 转基因和基因敲除鼠为缺血和再灌注细胞损伤及神经保护机制中相关基因和蛋白质的研究提供新的方法[20-22]。线栓法也可应用于转基因或基因敲除小鼠,并可通过控制术中的通气、麻醉来控制多种生理学指标[23]。H attori等[24]报道MCAO术后小鼠的行为和认知改变。

4.3 大型动物模型 狒狒属于大型动物,可用于同时测量多项生理参数。Symon等[8]在狒狒局灶性脑缺血模型完成后3年对其进行脑血流量测量,发现即使无明显的病理学改变,许多梗死灶周围组织的脑血流量仍较低,梗死灶周围组织对二氧化碳的反应性及脑血流自动调节均受到损害。以狒狒为实验动物的MCAO模型神经缺损症状与人类较相似,还可对狒狒进行神经系统检查;狒狒在大脑中动脉阻断的当时即出现面肌及上肢肌肉无力,数月后可能恢复。

5 MCAO局灶性脑缺血模型的评价

Bederson等[25]提出大鼠MCAO模型的4级3分评价法:0分,无神经功能缺损症状,未见神经病学征象;1分,轻度神经功能缺损,大鼠被提尾悬空时病灶对侧前肢屈曲;2分,将大鼠放于软塑料板上,握住鼠尾,侧向推大鼠肩后,使鼠滑动数英寸,瘫痪侧阻力明显减低,但无转圈运动;3分,重度神经功能缺损,除2分的症状外,还出现转圈运动。Longa[26]改进 Bederson等的评分法,提出5级4分评分法:0分,无神经功能缺损症状;1分,不能伸展前爪,轻度神经功能缺损;2分,转圈运动,中度神经功能缺损;3分,向病灶对侧跌倒,重度神经功能缺损;4分,不能自发行走、意识水平下降。此外还可以根据脑电图特征[27]、直接观察脑膜微循环[28]、微透析结合高效液相色谱法[29]、组织形态学检查[30]等来评价。

综上所述,各种造模方法各有利弊,有不同的适用范围。模型的建立与研究目的是解决临床实际问题,需从不同的研究需求出发,建立合适的动物模型。

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R741;R743

A

1001-117X(2010)01-0053-03

10.3870/sjsscj.2010.01.015

*【基金课题】 国家自然科学基金(No.30670731)

2009-12-22