骨髓基质细胞治疗脑缺血过程中血管内皮生长因子对其趋化性作用的实验研究*

韩金玲,易黎,刘巧云,周竹青

1.北京大学深圳医院神经内科,广东深圳518036;2.汕头大学医学院,广东汕头515041

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是具有多向分化潜能的非造血干细胞,研究发现BMSCs注入脑内后,可向脑缺血部位迁移,分化成为神经元样细胞与胶质细胞,同时分泌胰岛素样生长因子(insulin like growth factor,IGF),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),神经生长因子(nerve growth factor,NGF),脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和内皮生长因子(endothelial growth factor,EGF)等多种细胞因子,这些细胞因子在脑损伤的修复过程中起着重要作用[1]。VEGF作为血管内皮细胞特异性的有丝分裂原,具有促进血管内皮细胞的增殖、迁移和诱导血管生成等作用[2],其对脑缺血的作用近年颇受关注。有报道,大鼠脑缺血后VEGF表达增加,补充外源性 VEGF后,脑缺血灶体积明显缩小。本实验旨在研究BMSCs治疗脑梗死过程中,外源性VEGF的补充对BMSCs向缺血部位迁移的趋化性作用。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:普通级成年SD大鼠30只,雌雄不限,体质量 250～320 g;2月龄SD大鼠,雌雄不限,均由广东省实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(粤)2008-0002(粤监证字 2008D007)。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要试剂与材料:DMEM/F12、胰蛋白酶(购于GIBCO公司),胎牛血清(购于天津灏洋公司),5-溴脱氧鸟苷(BrdU)(购于Sigma公司),2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(购于南京奥多尼福生物有限公司),小鼠抗BrdU单克隆抗体(购于中杉金桥公司),藻红蛋白(R-PE)标记的CD45抗体,异硫氰酸(FITC)荧光素标记的CD90抗体(购于Invitrogen公司),S-P试剂盒、胃蛋白酶、DAB显色试剂盒(购于福州迈新公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型的建立与分组 按照Longa改良线栓法[3]建立大鼠左侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型。大鼠苏醒后采用Longa 5分制评价造模是否成功。随机选取评分1～3分的大鼠脑行TTC染色,并在后续试验中行 HE染色来确定梗死灶。造模成功的大鼠随机分为对照组、BMSCs治疗组、BMSCs+VEGF治疗组,各组10只,分别于治疗1周和4周时处死大鼠,每时间点处死5只。

1.2.2 BMSCs的培养与鉴定 取2月龄SD大鼠2只,脱颈处死。75%酒精中浸泡5 min。无菌条件下分离出大鼠双侧股骨、胫骨。注射器抽吸培养液反复冲洗骨髓腔,冲出骨髓细胞。冲洗液收集于离心管中,1300 rpm/min离心5 min。弃上清液,加入含 10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素、2 mM/L L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养液1 mL重悬骨髓细胞,适度吹打制成单细胞悬液,接种于10 mm培养皿内。37℃、5%CO2、100%饱和湿度细胞箱内培养。培养3 d后第1次换液,弃上清液,除去非贴壁细胞,同时更换新鲜培养液。根据细胞生长情况,每3～5 d全量换液。细胞生长达80%～90%融合时,消化传代。细胞悬液离心,1300 rpm/min离心5 min,倾倒上清液,重悬细胞,1∶2传代,倒置相差显微镜下观察细胞形态。选第3代生长良好的细胞进行鉴定及后续实验。在第3代细胞接近90%融合时,消化收集细胞,PBS洗涤2次,取约1×106个细胞重悬于 100 μ L PBS中,分别加入适量R-PE标记的CD45抗体和FITC标记的CD90抗体蔽光4℃下染色30 min。PBS 洗涤 2 次,加500 μ L PBS 重悬,流式细胞仪检测分析。

1.2.3 BrdU体外标记BMSCs及检测标记率 将第3代的BMSCs消化离心,以1×105/mL密度接种于新培养皿中,待细胞50%左右融合时,换用含 10 μ moL/L BrdU的培养液继续避光培养72 h至细胞90%融合。PBS清洗2次后消化离心,收集细胞进行后续的移植试验。同样密度的细胞用同样方法接种于爬片处理的6孔板中进行BrdU标记。72 h后爬片上的细胞用4%多聚甲醛固定,用BrdU单克隆抗体,采用SP法进行BrdU免疫细胞化学染色,镜下观察标记率。随机记数 10个非重叠视野(×400),计算BrdU阳性细胞数占总细胞数的比例。

1.2.4 枕大池注射 BMSCs及 VEGF MCAO造模成功24 h后,将BMSCs治疗组大鼠再次腹腔麻醉。俯卧位,颈部拱起,后颈部剃毛、消毒。使用一次性BD注射器抽取用70 μ L生理盐水重悬的BMSCs(已用BrdU标记)1×106个,以枕外粗隆和颈椎最高点的中点为穿刺点,向两外耳道连线的中点方向进针。当针尖穿破环枕筋膜时,有突破感,回抽有少量脑脊液吸出,即为穿刺成功。缓慢注入细胞悬液,注射完毕后留针5 min,然后快速拔出针头,观察针眼无渗液,局部碘伏消毒。BMSCs+VEGF治疗组大鼠,在注入BMSCs后的48 h、72 h和96 h,用同样的方法分3次枕大池注入含20 ng VEGF的生理盐水50 μ L。对照组大鼠以同样的方法经枕大池注入生理盐水70 μ L。做好标记,分笼饲养。试验过程中若有大鼠死亡,用经同样方法处理的大鼠补上。

1.2.5 取脑固定 在经过枕大池注射后的1周和4周,每组各取5只大鼠深度麻醉,常规4%多聚甲醛灌注后取脑,在前囟前后冠状切取2 mm脑片,入4%多聚甲醛中外固定4 h,送病理科常规脱水、浸蜡、包埋。

1.2.6 脑组织石蜡切片HE染色及BrdU免疫组织化学染色 以前囟为中心,冠状切取4 μ m厚石蜡切片,68℃烤箱烤片过夜,分别做HE染色和免疫组织化学染色。HE染色按常规步骤操作,分别在100倍及200倍光镜下观察梗死组织结构。免疫组织化学染色采用SP法,一抗为鼠抗 BrdU单克隆抗体,二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG。在400倍光镜下随机观察每只动物梗死灶周围不重叠的10个视野,显微图像分析系统采集图像。计数每个视野的阳性细胞数目。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件处理数据,计量资料以(±s)表示,组间比较采用独立样本均数 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠MCAO模型的评定 所有入组大鼠评分(Longa 5分法)为1～3分。随机选取各分值大鼠行 TTC染色后均可见到左侧皮质及基底核区呈苍白色的梗死灶。

2.2 BMSCs的传代、扩增、纯化与鉴定 冲出的骨髓细胞接种于培养瓶后,镜下观察多数为悬浮的大小不等的球形细胞。培养3 d时可见圆形、三角形、梭形细胞贴壁生长,有粗短突起,换液除去未贴壁细胞。原代培养第7、8天时,细胞分裂增殖明显,出现形态较均一的梭形细胞成集落生长,＞80%的细胞趋于融合。经胰酶消化后1∶2传代,传代后4～6 h内细胞基本贴壁,24 h后开始增殖,细胞集落增多。3～4 d可传代。连续3代细胞趋于纯化,形态变得均一,细胞呈梭形,似成纤维样细胞,胞界清晰,胞核饱满居中,呈漩涡样生长,见图1A。流式细胞仪结果显示细胞均一性较好,表面标志物鉴定结果为CD90(96.4%)阳性,CD45阴性,符合 BMSCs的特性,见图1B。

2.3 BrdU标记率 镜下观察BrdU标记的BMSCs形态、生长、增殖及分化均不受影响。标记72 h的细胞标记率可＞90%,见图1C。

2.4 HE染色及BrdU免疫组化染色结果

所有经过以上处理大鼠的脑片经HE染色后均能在左侧大脑半球发现梗死灶,梗死中心区神经元脱失明显,残存细胞多无完整细胞结构。梗死周边区未见明显神经元脱失,残存细胞可见坏死性及凋亡性细胞形态,表现为圆形或椭圆形的凋亡小体,边缘光滑,或胞浆及核固缩,细胞膜边缘有出芽状小泡等。BrdU免疫组织化学染色后可以见到对照组无明显阳性表达细胞;在治疗1周时,BMSCs治疗组及BMSCs+VEGF治疗组梗死灶周围的BrdU阳性细胞数目分别为(10.90±2.26)个及(20.48±7.39)个,治疗4周时,梗死灶周围的BrdU阳性细胞数目分别为(8.16±1.50)个及(12.54±2.79)个;2组在治疗1周时梗死灶周围的BrdU阳性细胞数目均显著多于4周时(P＜0.01),在治疗1周和4周时,BMSCs+VEGF治疗组梗死灶周围的BrdU阳性细胞数目均显著多于BMSCs治疗组(P＜0.01),见图2A-D。

3 讨论

实验证实,卒中后注入BMSCs可以穿过血-脑脊液屏障,到达损伤后的脑实质[4]。BMSCs在受损脑区可分泌一些生长因子如:IGF1、VEGF、NGF 、BDNF 和 EGF 等,这些因子可以减少缺血周边区的细胞凋亡,激活内源性营养反应如血管发生、突触发生和神经发生[5-10]。BMSCs治疗可减少MCAO大鼠的脑梗死体积、促进神经功能恢复,随着治疗时间的推移,梗死灶周围的BMSCs数目逐渐减少[11]。本实验采用贴壁离心法培养的BMSCs形态均一,检测其表面抗原为CD90(96.4%)阳性,CD45阴性。BrdU作为一种嘧啶类似物,是反映细胞DNA合成期及示踪标记的理想指标。本实验也观察到,BMSCs移植4周时,梗死灶周围的BrdU阳性细胞数目明显少于BMSCs移植1周时。

最新研究发现VEGF除具有生成血管的能力外,还能刺激细胞增殖,延缓衰老,抑制细胞凋亡,提高各种细胞的存活率[12,13]。在神经系统,VEGF在脑缺氧的情况中可以增加表达[14],增加血-脑脊液屏障的通透性[15],促进脑部血管的发生和神经的修复。

Schichor等[16]发现,VEGF可促进BMSCs向神经胶质瘤部位迁移,认为VEGF可能是增强细胞能动性的一个重要因子。Pons等[17]证实 VEGF在体外可减少 BMSCs的应激反应,增强细胞的增殖能力。在大鼠心肌梗死的心脏内注射 BMSCs+VEGF相比单独应用BMSCs或VEGF可明显提高植入细胞的存活量和改善心脏功能,且这种作用在BMSCs+VEGF治疗7 d时比28 d时更加明显[17]。Toyama等[18]也证实脑卒中后静脉内注射VEGF转染的BMSCs相比单独应用BMSCs或VEGF可在相关功能区产生更多微血管。

本实验中,在大鼠MCAO造模后24 h时通过枕大池注入 BMSCs,在联合应用VEGF治疗组,治疗早期(1周)梗死灶周围的BrdU阳性细胞数目较晚期(4周)显著增多,可能VEGF在治疗早期对BMSCs的增殖能力有比较显著地加强作用,随着治疗时间的延长这种作用逐渐减弱。本实验中,治疗1周和4周时,观察到BMSCs+VEGF治疗组均较单独应用BMSCs治疗组在梗死灶周围表达的BrdU阳性细胞数目多,增加外源性VEGF可能促进BMSCs向梗死灶周围迁移,并且在治疗1周时这种促进迁移作用较治疗4周时明显。

本研究结果显示,VEGF可促进BMSCs向梗死灶周围迁移,提高BMSCs的潜在治疗价值,这种作用在治疗的早期(1周时)阶段更加明显。

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