评价血液ST13和BCL11B基因表达水平在帕金森病早期诊断中的潜在价值

陆学胜,许敏,张燕,姚胜旗,张允,董强

1.上海市长宁区中心医院神经内科,上海200336;2.复旦大学附属华山医院神经内科,上海200040

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常见的多发生于中老年的退行性神经病变,其主要病理生理学特征是中脑黑质和纹状体多巴胺能神经通路变性。多巴胺的合成减少,抑制乙酰胆碱的功能降低,乙酰胆碱的兴奋作用相对增强,两者的失衡引起一系列临床症状。大多数原发性PD患者起病多＞60岁,约20%的病例起病＜40岁,极少数人可在儿童期或青春期发病。临床上PD的典型表现为进行性运动徐缓、肌强直及震颤、姿势反射障碍、脑脊液中多巴胺代谢产物高香草酸含量降低等[1]。

目前对于PD多主张早期采用神经保护剂治疗,这对疾病的早期诊断提出了较高的要求。然而迄今为止PD的诊断仍主要依赖临床表现,诊断的准确性和特异性在很大程度上受到医师临床经验的影响,这给亚临床、疾病早期以及不典型PD患者的诊断带来很大困难[2]。近十年来,随着人类基因组计划的实施和蛋白质组学的发展,分子生物学诊断正逐步被运用于退行性神经变性疾病中。对PD而言,筛查出能在疾病早期检测到的、有特异性的标记物有利于提高亚临床或临床前期患者的确诊率,对PD的积极预防、早期治疗以及改善患者的生活质量和延长生命都有十分重要的意义。

早年研究曾提示编码α-synuclein、Parkin、泛素羧基端水解酶 L1、DJ-1蛋白、PINK1、富含亮氨酸重复激酶2等基因的突变可能与PD的发生有关[3-8],同时也有研究提示载脂蛋白E2/E4的多态性可能和PD的易感性相关[9,10]。然而,后续研究并未能证实这些基因表达的异常或多态性能运用于PD的早期诊断[11]。2007年,通过比较PD患者与对照组的外周血液样本,Scherzer等[12]报道有22个基因的表达水平在PD患者中出现明显变化,而其中又以大肠癌负相关基因ST13和B细胞淋巴瘤/白血病基因家族成员BCL11B表达的下调最为明显。Scherzer等因此猜测这2个基因或许可以作为PD诊断的分子标记物。然而,先前的研究只局限于少数病例和对照组的比较,而且尚未对PD患者的病情进行分级,因此目前对这2种基因的表达在PD各阶段中的变化规律尚不明确,也不清楚两者是否有可能运用于PD的早期诊断。

为了进一步明确ST13和BCL11B基因在PD病程中的表达变化规律,也为探索它们在早期诊断PD中的应用价值,本研究收集各期PD患者和自愿健康对照者的外周血液样本,比较两者在各组间的差异。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究经由医院伦理委员会批准,所有受试者均知情同意。选择PD患者99例为PD组,男女比例为51∶48;平均年龄(57.5±6.8)岁。另选取健康志愿者20例为对照组,男女比例为1∶1;平均年龄(54.5±6.7)岁。2组一般资料比较差异无统计学意义,均接受全面的临床检查,包括:病史询问、体格检查、神经系统专科检查、常规化验、心电图、胸部X线及脑部CT和/或MRI扫描。PD的临床诊断参照美国国家神经疾病与中风学会制定的诊断标准[13]。PD组的临床分级仍是采用Margaret Hoehn和Melvin Yahr于1967年制定的分级方法(Hoehn-Yahr分级)[14]:Ⅰ期,单侧身体受影响,功能减退很小或没有减退;Ⅱ期,身体双侧或中线受影响,但无平衡功能障碍;Ⅲ期,受损害的第1个症状是直立位反射,当转动身体时出现明显的站立不稳或当两脚并立,身体被推动时不能保持平衡,患者有某些工作能力的损害,但能完全过独立生活;Ⅳ期,严重的无活动能力,但患者仍可自己走路和站立;Ⅴ期:除非得到帮助只能卧床或坐轮椅。排除伴有任何精神疾病或任何除PD之外的退行性神经病变的患者,任何患有神经变性疾病的患者,脑肿瘤、脑卒中患者,任何脑内炎性疾病以及系统性病变(如类风湿关节炎、糖尿病、高血压等)患者。PD患者的治疗主要依据第2版《中国帕金森病治疗指南》(简称《指南》)[15]。对于尚未使用《指南》中涉及药物或手术进行治疗的PD患者,本研究将其视为未治疗者,见表1。由于PD组24名Hoehn-Yahr I级患者症状轻微,且均未开始接受正规治疗,在本研究中被视为原发性早期PD病例。

表1 PD组 Hoehn-Yahr分级

1.2 方法 所有的血液样本于清晨7点在受试者空腹状态下采集。血样在进行分析前保存在4℃冰箱内,保存时间不超过2 h。采用QIAamp血液RNA试剂盒(Qiagen)提取外周血淋巴细胞RNA。并对每个样本的RNA含量用分光光度计定量。提取每个样本50 ng RNA,经Invitrogen Superscript III试剂盒合成相应的cDNA,并用 TaqMan实时定量PCR进行ST13和BCL11B检测,检测结果用管家基因RPLP0进行标化。ST13引物序列为5'-AAG CCC TAA ATG ATG GTG AAC TC-3'(正向)和 5'-GCT CTG TCA CAG TCT CGG A-3'(反向),产物大小154 bp;BCL11B引物序列为5'-TCA AAT GAA CTT CCC CTT GG-3'(正向)和5'-ACC TGC AAT GTT CTC CTG CT-3'(反向),产物大小247 bp;RPLP0引物序列为5'-GGC GAC CTG GAA GTC CAA CT-3'(正向)和 5'-CCA TCA GCA CCA CAG CCT TC-3'(反向),产物大小194 bp;betaactin引物序列为5'-GTC TTC CCC TCC ATC GTG-3'(正向)和5'-AGG TGT GGT GCC AGA TTT TC-3'(反向),产物大小181 bp。PCR反应条件为 94℃预变性300 s,94℃变性40 s,56℃退火50 s,72℃延伸30 s,其中变性、退火、延伸3者循环 40次,最后72℃延伸5 min。

1.3 统计学处理 SPSS 15.0统计软件处理数据,计量资料以(±s)表示,t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实时荧光定量PCR比较对照组和各级PD患者外周血淋巴细胞中ST13和BCL11B的表达水平,见图1。PD组Hoehn-YahrⅡ-Ⅴ级的患者外周血的ST13表达水平分别为对照组的(0.51±0.29)倍、(0.43±0.22)倍、(0.47±0.14)倍和(0.43±0.16)倍,均有统计学差异(P＜0.05)。Hoehn-YahrⅠ级患者的ST13表达水平为对照组的(0.81±0.31)倍,无统计学差异,见图 2a。PD组Hoehn-YahrⅡ-Ⅴ级患者外周血中BCL11B的表达量分别为对照组的(0.59±0.26)倍、(0.69±0.31)倍、(0.60±0.24)倍和(0.64±0.28)倍,均有统计学差异(P＜0.05)。与ST13不同,Hoehn-YahrI级患者的BCL11B表达水平为对照组的(0.61±0.32)倍,也有统计学差异(P＜0.05),见图2b。另外,由于25例Hoehn-YahrⅡ级患者中有16例(64%)未接受过《指南》[15]中所涉及的药物或手术治疗,将其作为未接受治疗亚组与其他83名已接受治疗的患者进行了比较,统计结果显示,ST13和BCL11B的表达水平在2亚组间无统计学差异,见图2c。

3 讨论

PD的亚临床诊断非常困难,当患者出现首发症状时,其脑内的病理改变已非常显著。据统计,PD首诊患者黑质致密部多巴胺能神经元平均已丧失约60%～80%,而壳核的多巴胺水平也较正常人下降约80%[1,16]。如果能找到PD的特异性标志物,那么就可以在较大人群范围内对PD进行筛查,及早发现亚临床和临床早期PD患者,及时进行治疗,达到推迟或避免临床症状恶化的目的。本研究展示了外周血ST13和BCL11B基因表达的变化与临床各期PD的关系,并探讨了它们在诊断早期PD患者中的应用价值。

ST13基因是近几年新发现的一种与大肠癌发病有负性相关的基因,其序列与伴侣分子p48完全相同,故被认为是同一蛋白。ST13/p48还被称为Hip或热休克蛋白结合蛋白。ST13基因定位于人染色体22q13,cDNA全长3145 bp。BCL11包括BCL11A和BCL11B基因,是 B细胞淋巴瘤/白血病(B-cell lymphoma/leukemia,BCL)家族的新成员。该家族蛋白在细胞的增殖和抗凋亡等方面起重要作用。BCL11B编码一种锌指蛋白,该基因的转位和表达异常可能与淋巴细胞恶性转化有一定的关系,但目前对BCL11B的具体功能还不是非常清楚。2007年,Scherzer等[12]比较健康对照者和PD患者的周围血样,发现有22个基因的表达在PD患者中明显下调,其中又以 ST13和BCL11B最为显著,因此推测检测这2种基因的表达可能有助于PD的诊断。本研究发现,虽然在较高级别的 PD患者中ST13和BCL11B的表达均有明显下调,但在Hoehn-YahrⅠ级患者中只有BCL11B的表达水平与健康对照组有明显不同,而ST13表达至少要在Hoehn-YahrⅡ级患者中才出现明显异常。因此,如果两个基因确证能应用于PD诊断,那么就早期诊断的敏感性而言,BCL11B更具有优越性。

然而,如果要将ST13、BCL11B、或者其他潜在的PD分子标记物运用于临床诊断,一个必需阐明的问题是这些标记物是否具有特异性。也就是说,这些标记物的出现、消失、上升、或下调是否只有在PD患者中才出现。就目前的研究结果来看,要找到PD特异的标记物还非常困难。许多潜在的PD分子标记物(如载脂蛋白E等)在其他退行性神经病变中也可能出现较明显的变化。但是,如果将几个标记物进行联合检测,理论上应该可以提高诊断的特异性,这可能是今后一段时间内PD分子诊断的研究方向。

PD患者的外周血 ST13和BCL11B表达水平均较健康对照组有明显下降,是潜在的可作为PD分子诊断的标志物。BCL11B的表达在Hoehn-YahrⅠ级的早期PD患者中就明显下降,而ST13要在Hoehn-YahrⅡ级以上患者中才表现出差异。因此,就敏感性而言,BCL11B优于ST13。

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