含CXCL12基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定*

汪琦,徐逸,王伟 ,朱舟

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科,武汉430030

趋化因子(chemokine)是一类小分子量的分泌蛋白,在炎症和免疫反应中起重要作用。根据其N末端2个半胱氨酸残基的空间位置不同可分为CXC、CC、C和CXC3C亚族。CXCL12属于CXC亚族,其cDNA最初由小鼠骨髓基质细胞克隆而来,故也被命名为基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)。CXCR4为CXCL12的受体,两者之间为一对一关系。在外周免疫系统中,CXCL12发挥多种重要作用[1,2]。此外,骨髓来源前体细胞(干细胞)能够顺CXCL12浓度梯度到相应部位,参与造血前体细胞向骨髓的归巢、血液和淋巴系统、血管、小脑和感觉侧索等组织的胚胎发育[3-8]、类风湿疾病[9]、肿瘤的生长、发育和转移[10]等。

CXCL12和CXCR4在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中广泛表达。在HIV相关脑病[11,12]、脑肿瘤[13]、卒中[14]等CNS疾病中,CXCR12可能发挥重要调节作用,CXCR12还参与多种神经退行性疾病的病理过程,如阿尔茨海默病(Alzheimer's disese,AD)[15,16]等。本文拟构建含CXCL12和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒表达载体,为进一步研究CXCL12在CNS疾病发病机制中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂与材料:Adeno-XTMExpression System 1(购于Clontech公司);含CXCL12全长cDNA质粒pmCherry-CXCL12由美国Northwestern University大学Richard J.Miller教授惠赠(该质粒同时带有红色荧光蛋白mCherry基因和小鼠CXCL12基因);限制性内切酶 Nhe I、Not I、Apa I、Xho I,PCR试剂盒,T4连接酶(购于日本Fermentas公司);限制性内切酶Pac I(购于NEB公司);质粒小量提取试剂盒(购于美国Omega公司);小量胶回收试剂盒(购于上海华舜生物公司);阳离子脂质体Clonfectin(购于 Clontech公司);高糖 DMEM 培养基,胎牛血清、小牛血清(购于 Hyclone公司);冻存293细胞由本实验室保存;Olympus IX81型荧光倒置显微镜(购于Olympus公司)。

1.2 构建含有目的基因的质粒 将pm-Chenry-CXCL12和pEGFP-N1经Not I和Apa I酶切后相连,构建成为表达绿色荧光的目的基因pEGFP-CXCL12。

1.3 穿梭质粒pShuttle2-EGFP-CXCL12的构建 pEGFP-CXCL12和 pShuttle2均经Nhe I和 Not I双酶切,用连接酶连接成pShuttle2-EGFP-CXCL12,转化感受态DH5α,铺板、挑单菌落、扩增并酶切和测序鉴定。同时将空载体pEGFP-N1和pShuttle2均经Nhe I和Not I双酶切,用连接酶连接成pShuttle2-EGFP作为对照。

1.4 重组腺病毒质粒 pAdeno-EGFP-CXCL12的构建及鉴定 将pShuttle2-EGFPCXCL12和pShuttle2-EGFP分别用I-Ceu I和PI-Sce I双酶切后,回收2.1kb和1.8kb的酶切片段,各自与Adeno-XTMExpression System试剂盒中的腺病毒骨架质粒pAdeno-X(已用I-Ceu I和PI-Sce I切开)连接,得到pAdeno-EGFP-CXCL12和pAdeno-EGFP,按常规方法转化感受态 DH5α,铺板、挑单菌落、扩增提取,酶切鉴定。

1.5 重组腺病毒载体Ad-EGFP-CXCL12的包装及鉴定 大量提取重组腺病毒质粒pAdeno-EGFP-CXCL12,Pac I酶切成线性,酚氯仿异戊醇抽提纯化,用 1 μ g/μ L Clonfectin 脂质体 10 μ L 和100 μ L无血清无抗生素OPT-MEM 培养基混合,将6 μ g Pac I酶切线性化产物与100 μ L OPT-M EM 培养基混合,将 200 μ L Clonfectin/DNA 混合物转染六孔板内50%～70%生长融合的293细胞。转染48 h后在荧光倒置显微镜下观察细胞EGFP的表达情况,观察细胞形态,当出现细胞病变时,-80℃/37℃反复冻融3次,裂解细胞收集病毒作为原代重组腺病毒用于大量扩增。抽提病毒DNA为模板,以CXCL12cDNA内1段225 bp的序列设计引物,上游引物 5'-ACGCCAAGGTCGTCG CCGTGC-3',下游引物5'-TAATTTCGGGTCAATGCACAC-3',反应条件94℃45 s,55℃40 s,72℃45 s,30个循环,最后72℃10 min延伸,对病毒进行鉴定。同时扩增GAPDH作为内参,片段长度594 bp,上游引物5'-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3',下游引物5'-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3',反应条件同前。

2 结果

2.1 穿梭质粒pShuttle2-EGFP-CXCL12的鉴定 挑菌落扩增,提取重组质粒。pShuttle2-EGFP-CXCL12经EcoR I单酶切后电泳,完全酶切结果为1.3 kb和3.8 kb的条带各1条;对照空载质粒pShuttle2-EGFP经EcoR I单酶切后,完全酶切结果为0.7 kb和4 kb的条带各1条,见图1。经I-Ceu I和PI-Sce I酶切后,pShuttle2-EGFP-CXCL12得到2.1 kb和2.9 kb条带各1条,pShuttle2-EGFP得到1.8 kb和2.9 kb条带各1条,见图2。鉴定后将pShuttle2-EGFP-CXCL12菌液测序,所测序列与Genebank的序列完全一致,见图3。

2.2 重组腺病毒质粒 pAdeno-EGFP-CXCL12的鉴定 氨苄青霉素筛选后,扩增存活菌落提取质粒,Xho I酶切,电泳观察结果。没有重组的腺病毒骨架pAdeno-X酶切条带分布是 14.5 kb、8 kb、5.7 kb、2.5 kb、1.4 kb、0.6 kb,重组的腺病毒质粒pAdeno-EGFP-CXCL12经完全酶切结果为14.5 kb、8 kb、4.4 kb、2.6 kb、2.5 kb(2.5 kb和2.6 kb条带重合)、1.4 kb 、0.6 kb(DNA 浓度低不可见);重组腺病毒质粒pAdeno-EGFP经完全酶切结果为14.5 kb、8 kb、7.6 kb(7.6 kb和 8 kb 重合)、2.5 kb、1.4 kb、0.6 kb(DNA浓度低不可见),见图4。

图4 pAdeno-X(条带1)、pAdeno-EGFP-CXCL12(条带 2)及 pAdeno-EGFP(条带 3)经 Xho I酶切后电泳结果

2.3 重组腺病毒载体Ad-EGFP-CXCL12的包装及鉴定 脂质体转染pAdeno-EGFPCXCL12入293细胞后48 h,荧光倒置显微镜下可见细胞内有 EGFP的表达,逐渐增多,并有部分 EGFP表达呈彗星状分布,见图5A-B。第4～5天,293细胞出现收缩、变圆等病理改变,第9～10天细胞出现噬斑,噬斑周围病变细胞呈圆形,聚集成葡萄状,第12天有部分细胞剥离。细胞经裂解后,离心获得含病毒上清,以病毒DNA为模板,PCR扩增出225 bp的特异性条带,见图6。

3 讨论

CXCR4广泛分布于神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞及内皮细胞,CXCL12主要由星形胶质细胞和血管内皮细胞分泌。在生理情况下,CXCL12/CXCR4参与CNS的发育、神经干细胞的迁移和增殖,促使星形胶质细胞分泌谷氨酸,参与多巴胺分泌等,在神经递质的调节及神经元-胶质细胞或胶质细胞-胶质细胞之间的信息沟通中发挥重要作用。在某些病理情况下,如HIV相关痴呆、脑梗死、多发性硬化等,CXCL12的表达明显上调或下调,提示该趋化因子参与这些疾病的病理过程。

骨髓来源的干细胞能够被动员进入外周循环,并在特定的组织环境下分化为组织特异的细胞系[17]。在CNS,骨髓来源的干细胞能够穿过血-脑脊液屏障进入脑实质,尤其在病理情况下,如AD、脑梗死等,骨髓来源的干细胞能够被趋化到病灶周围,参与疾病的发生和发展[14,18]。由于骨髓来源干细胞重要的治疗价值,其趋化调节的机制受到越来越多的关注。

骨髓干细胞向外周组织的趋化受到多种因素的精细调节,其中最重要的调节因素之一就是趋化因子,CXCL12是其中的重要成员。研究发现,在脑梗死中CXCL12表达增加,并与梗死区单核细胞的浸润相关,提示CXCL12参与脑梗死的炎症过程[21]。CXCL12还参与调节骨髓来源干细胞向脑梗死区和脊髓损伤区域的募集,这些被募集的干细胞在特定微环境可能分化为神经元、胶质细胞或血管内皮细胞,帮助神经功能重建[19-21]。在AD的研究中发现,AD患者血清和脑脊液中 CXCL12水平下降,提示在AD患者CNS中缺乏造血干细胞的支持,不利于神经功能修复[15];研究还发现骨髓造血干细胞能够穿过血-脑脊液屏障,并分化为具有高效吞噬功能的小胶质细胞[18],促进Aβ清除,CXCL12可能参与这类骨髓来源的小胶质细胞向CNS的趋化。尽管各种研究提示CXCL12参与许多CNS疾病的病理过程,但具体的机制目前尚不清楚,明确CXCL12在这些疾病中的作用可能为疾病的治疗提供新的靶点。

本研究成功构建腺病毒表达载体Ad-CXCL12-EGFP,该腺病毒表达载体通过转染神经细胞能够模拟CNS内的CXCL12表达上调,由于同时连接 EGFP作为报告基因,适用于固定后和其他荧光标记进行多标实验,并可通过荧光表达强度了解目的基因CXCL12的表达。

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