AG1478对大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生的影响*

李在望,唐荣华,张剑平,詹艳,田代实#,王伟

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科,武汉430030;2.南京医科大学附属无锡市人民医院神经内科,江苏无锡214023

外伤所致的脊髓损害常导致严重的神经功能缺损,脊髓损伤后,星形胶质细胞过度增生是阻碍损伤轴突再生的一个重要原因[1-3]。反应性星形胶质细胞增生所形成的致密胶质瘢痕可产生物理屏障作用,阻碍再生轴突的爬伸,反应性星形胶质细胞还可分泌大量生长抑制因子,对损伤轴突的再生起着明显的抑制作用[4,5]。因此抑制星形胶质细胞的过度增生可能有利于脊髓损伤后的轴突再生。

近来有研究显示,表皮生长因子受体(epidermal grow th factor receptor,EGFR)在脊髓损伤后星形胶质细胞上明显活化[6],表皮生长因子活化可导致静止星形胶质细胞活化增殖[7],表皮生长因子受体配体可刺激星形胶质细胞增生形成胶质瘢痕及大量分泌生长抑制因子[8]。这些研究结果提示,星形胶质细胞上EGFR的活化与胶质细胞反应性增生有直接联系[9]。因此抑制EGFR的活化可能会减少胶质细胞过度增生。有研究显示,给予EGFR抑制剂AG1478可促进损伤的视神经再生[10]。

本研究通过在损伤脊髓局部应用EGFR抑制剂AG1478治疗大鼠脊髓损伤,研究AG1478是否能缓解脊髓损伤后的反应性胶质瘢痕形成及促进神经功能恢复。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:健康成年雌性SD大鼠60只,体质量220～250 g,由华中科技大学同济医院实验动物中心提供。②主要试剂与材料:AG1478、鼠抗胶质纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP)(购于 Sigma公司);兔抗磷酸化表皮生长因子受体(phosphorylated epidermal growth factor receptor,pEGFR)抗体(购于Santa cruz公司);花青素3(Cyanine 3,Cy3)标记的羊抗兔IgG、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate,FITC)标记的羊抗鼠IgG、β-actin、辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的羊抗鼠IgG(购于武汉博士德生物工程有限公司);按勒克司坚牢蓝 Luxol Fast Blue染色试剂盒(购于GenMed Scientifics公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 60只大鼠随机分为假手术组,对照组和AG1478组,各20只。应用Gruner标准打击器法[11]建立大鼠脊髓损伤模型。10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,腰背部脱毛后俯卧位固定,常规消毒后在无菌条件下以T10棘突为中心作背部后正中切口,咬除T10棘突及其椎板,椎管打开至椎弓根部,充分暴露T10脊髓(硬脊膜完整保留),应用标准打击器(纽约大学打击器)以10 g的打击棒(打击棒头部直径2 mm)从1.25 cm高处自由下落撞击脊髓,造成大鼠不完全截瘫,出现脊髓充血,双下肢痉挛抖动,尾巴痉挛性摆动,视为造模成功。打击损伤完成后,动物随机分成AG1478组和对照组。假手术组仅切除椎板暴露硬脊膜。AG1478组于造模后立即将含有AG1478[0.2 mL(2 mM)溶于 DMSO]的明胶海绵外敷于损伤脊髓节段,仔细止血,对照组和假手术组于造模后立即将仅含有DMSO(0.2 mL)的明胶海绵外敷于损伤脊髓节段,依次缝合竖脊肌、皮下组织及皮肤,局部覆盖无菌纱布。术后腹腔注射青霉素(8万U/d)抗感染,室温保持在20℃～25℃,湿度40%～70%,增加蛋白营养,每天人工按摩膀胱排尿2次,直至恢复自主排尿(约5～7 d)。

1.2.2 免疫荧光染色 大鼠脊髓损伤后第14天将各组大鼠(均随机取5只)经腹腔注射10%水合氯醛(600 mg/kg)深度麻醉,自左心室通过静脉套管快速灌注生理盐水冲洗,待流出清亮液体后,灌注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB)固定1 h,暴露脊髓,切取损伤节段长约1.0 cm的脊髓,置于上述相同液体中,后固定4 h,移入含20%蔗糖的PB中4℃过夜。待组织块沉底后经恒冷箱冰冻切片机切片,片厚10 μ m,并将切片固定于多聚赖氨酸包被的玻片上。切片以5%的正常山羊血清封闭1 h,滴加一抗[兔抗pEGFR抗体(1∶100稀释)与鼠抗GFAP(1∶200稀释)的混抗体]孵育4℃过夜。过夜后PBS洗5 min×3次,滴加二抗[羊抗兔Cy3(1∶200稀释)和羊抗鼠FITC(1∶200稀释)的混抗体],37℃下作用 1 h,PBS洗 5 min×3次,甘油封片。荧光显微镜下摄像。彩色病理图文分析系统进行图像分析。每次实验均设立空白对照。

1.2.3 Western印迹 各组大鼠(每组5只)于伤后14 d,28 d时快速剥取损伤节段脊髓组织,加入裂解液冰上孵育并彻底匀浆,离心后留取上清,BCA法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白;全湿式电转法转移到NC膜上;5%脱脂奶粉封闭2 h,分别加入一抗(鼠抗GFAP,1∶2000稀释);内参为βactin(1∶300稀释),4℃孵育过夜。用TBST溶液洗涤10 min×3次;加入二抗(HRP标记羊抗鼠IgG,1∶1000稀释),4℃过夜;TBST洗膜10 min×3次,加ECL发光显示液在暗室中摄像。凝胶成像分析系统进行分析,结果以目的条带灰度值与同一样本内参β-actin灰度值的比率来表示。

1.2.4 髓鞘Luxol Fast Blue染色 将含损伤部位的各组脊髓组织(每组5只)纵向切成20 μ m 的切片,Luxol Fast Blue(LFB)染色操作过程按勒克司坚牢蓝染色试剂盒说明操作。Olympus BX-51光学显微镜下摄像,Image-Pro Plus分析软件分析髓鞘脱失面积。以脊髓正中心切片来计算髓鞘脱失的面积。1.2.5 动物行为学评分 在脊髓损伤后第1天和以后每周观察各组大鼠行为学的改变,观察者为非本组实验人员。应用BBB评分[12]评定大鼠脊髓神经功能,最小值为0分,表示未见后肢运动,最大值为21分,表示功能完全正常。

1.3 统计学处理 SPSS 15.0统计软件处理数据,计量资料以(±s)表示,方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pEGFR和GFAP免疫荧光双标结果假手术组pEGFR表达很弱,pEGFR和GFAP双标无阳性表达;对照组 pEGFR强表达,pEGFR和GFAP双标明显阳性表达;AG1478组pEGFR几乎没有表达,pEGFR和GFAP双标无阳性表达,见图1A-D。

2.2 GFAP表达的Western印迹检测结果

假手术组中GFAP的表达量很低,对照组中GFAP的表达明显上调,损伤28 d后,GFAP的表达更加明显。AG1478组中GFAP的表达较对照组明显减少(P＜0.01),几乎与假手术组的表达量相当,见图2A-B。

图1 A-D 各组pEGFR和GFAP免疫荧光双标染色结果 A1-A3:假手术组,GFAP、pEGFR的表达较弱,二者无重叠区域;B1-B3:对照组,损伤区域有囊腔形成,周边星形胶质细胞明显活化,GFAP与pEGFR染色较强,二者存在重叠区;C1-C3:AG1478组,GFAP和pEGFR表达明显减弱,二者无重叠区域,胶质细胞增生显著受抑,未见明显的胶质瘢痕形成;D1-D3:对照组高倍镜下图像 。 A1-C3:bar=500 μ m,D1-D3:bar=50 μ m;红色荧光表示pEGFR,绿色荧光表示GFAP,黄色荧光表示pEGFR和GFAP的重叠区。

2.3 髓鞘LFB染色结果 假手术组整个脊髓的髓鞘组织均可正常均匀着色;对照组脊髓损伤中心区组织不能着色,提示有大量髓鞘脱失;AG1478组脊髓组织损伤区不着色的范围明显小于对照组(P＜0.01),见图3A-D。

2.4 神经功能评定及体重改变情况 造模后,大鼠双后肢瘫痪,无后肢运动。AG1478组大鼠于损伤后1周BBB评分开始提高,损伤后8周BBB评分持续增加,损伤后第8周BBB评分到达15分,大鼠后肢能持续足底负重步行,持续协调足底步行。对照组损伤后运动功能恢复程度较小,至损伤后4周对照组大鼠BBB评分达到平台期,评分为10分,后肢偶见足底负重步行,没有前后肢的协调运动。AG1478组大鼠损伤后BBB评分显著高于对照组大鼠(P＜0.01)。AG1478组大鼠于损伤后第1周体重出现下降,但损伤后第2周体重开始恢复,且一直持续到损伤后8周。对照组大鼠损伤后体重持续下降,至损伤后第3周下降趋势停止,从损伤后4周开始出现极小幅度的体重增长。2组大鼠损伤后体重存在明显差异(P＜0.05),见图4A-B。

3 讨论

外伤性脊髓损伤后脊髓传导束纤维不能有效再生,其原因与中枢神经系统再生能力极差有关,更重要的是脊髓损伤后反应性胶质瘢痕可对损伤轴突的再生产生极其不利的影响[2,13]。反应性胶质瘢痕不仅组成致密的物理屏障阻碍轴突爬伸,活化的星形胶质细胞还可分泌大量轴突生长抑制因子,形成生物屏障阻碍轴突再生[2]。抑制星形胶质细胞过度增生有助于改善轴突再生环境。

脊髓损伤后直接触发星形胶质细胞增生的因素尚未完全明了,有研究显示EGFR配体表皮生长因子是导致星形胶质细胞增生的重要因素[14]。脊髓损伤后EGFR的表达明显增高,且EGFR表达的上调与脊髓神经功能恢复成负相关[15]。本实验中,脊髓损伤后pEGFR的表达明显上调,且与GFAP存在共染区,表明脊髓损伤后星形胶质细胞表达pEGFR,与以前的实验结果一致[6]。在本实验中,局部给予 EGFR抑制剂 AG1478后,pEGFR的表达被明显抑制,GFAP的表达也受到明显抑制,这表明AG1478不仅明显抑制pEGFR的表达,也抑制反应性胶质增生。

本实验的结果还提示脊髓损伤后应用AG1478治疗可以明显改善脊髓损伤所导致的髓鞘脱失,这对提高脊髓轴突再生能力极其有意义[16]。行为学评分显示 AG1478组大鼠在伤后的BBB评分明显高于对照组,提示AG1478治疗促进大鼠神经功能的恢复。本实验的结果提示 AG1478可能通过阻断EGFR通路,阻碍星形胶质细胞活化,抑制过度胶质增生,改善轴突再生环境,表现出神经保护作用。

综上所述,在脊髓损伤局部给予EGFR抑制剂AG1478可以明显促进脊髓损伤大鼠后肢的神经功能恢复,其作用机制可能与AG1478阻断星形胶质细胞上的EGFR通路,抑制胶质细胞过度增生有关。AG1478在脊髓损伤中显示出的良好治疗作用,EGFR抑制剂可能在脊髓损伤治疗方面有很好的应用前景。

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