不同时间点电针治疗对脑梗死大鼠Bcl-2 mRNA转录及caspase-3蛋白表达的影响*

李嫚,宋艳玲,王梦嵽,梅元武,黎刚,方瑗

华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科,武汉430032

电针有疏通经脉、调理气血的作用,能扩张血管,促进血栓的溶解吸收,作为缺血性脑血管病的非药物疗法之一,其卓越疗效已得到验证。被公认可用于脑血管病恢复期的治疗,有学者认为电针治疗在缺血再灌注损伤后早期进行疗效更佳[1],但早期何时开始治疗疗效最佳尚无定论。本研究通过观察大鼠脑缺血再灌注后不同时间点开始电针治疗,对凋亡调控相关因子B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(B-cell lymphoma gene-2,Bcl-2)mRNA转录和半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(caspase-3)表达的影响,初步寻找电针治疗脑梗死的最佳时间窗,并探讨可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:12周龄雄性SD大鼠100只,体质量(250±30)g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。②主要试剂与材料:Trizol(购于Invitrogen公司),逆转录酶M-MLV(购于 Promega公司),SYBR Green I(购于 Biotium公司),兔抗 caspase-3单克隆抗体、生物素标记的羊抗兔IgG(购于武汉博士德生物工程有限公司),5810R台式高速大容量离心机(购于 Eppendorf公司),7700型荧光定量PCR仪(购于ABI公司),引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 局灶性脑缺血再灌注模型制备及分组 100只SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组及电针组,各组再根据术后开始针刺治疗的时间点,分为术后 6 h、12 h、24 h、48 h及72 h共5个亚组,每亚组5只大鼠。参照廖维靖等[2]介绍的改良Zea Longa线栓法制作左侧大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)动物模型(模型组及电针组)。假手术组大鼠手术操作与模型组及电针组相同,但术中不阻断大脑中动脉血流。正常组不给予任何手术处理。

1.2.2 穴位定位及电针干预 根据大鼠针灸穴位定位法[3]及拟人比照法定位,选取百会、大椎穴。医用15 mm,28号毫针刺入穴位,接G6805-2型电针仪,同一输出电极接同侧两穴。刺激参数:疏密波,疏波2 Hz,密波30 Hz,电流强度2 mA,输出电压2～4 V,以局部轻颤为度,刺激时间30 min/次,针刺分别在造模后 6 h、12 h、24 h 、48 h 、72 h 开始,2次/d(9∶00和17∶00),连续14 d。其它 3组仅作相应时间点捆扎,不进行针刺。

1.2.3 大鼠梗死灶Bcl-2 mRNA转录水平检测 各组实验大鼠于治疗14 d后深度麻醉,冰盘上快速断头取脑,切取梗死灶周边脑组织约100 mg,加入 Trizol溶液0.5 mL,常规方法提取mRNA,紫外分光光度计测定其浓度及纯度;在逆转录酶M-M LV作用下,将mRNA逆转录成 cDNA分子,采用 SYBR Green I荧光染料技术进行实时定量多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),以获取各组标本标准曲线,采用计算机分析Ct值。引物设计序列如下:Bcl-2上游引物:5'-GGGACGCGAAGTGCTATTGGTA-3';下游引物:5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATGC-3'。

1.2.4 大鼠梗死灶caspase-3蛋白表达的免疫组织化学检测 各组实验大鼠于治疗14 d后断头取脑,常规石蜡包埋、切片(连续4 μ m冠状切片5张备用)。取相同层面的2张切片,SABC法检测caspase-3蛋白的表达。一抗为兔抗caspase-3单克隆抗体(1∶100稀释),二抗为生物素标记的羊抗兔IgG,显色后光镜下观察。caspase-3阳性细胞胞质内出现棕黄染色颗粒。

1.2.5 图像分析 每张切片取梗死侧不重复的5个视野照相,LEICA Qwin图像处理与分析系统进行图像分析,检测其灰度值。

1.3 统计学处理 SPSS 12.0统计软件处理数据,计量资料以(±s)表示,主效应及交互效应统计选用多组重复测量方差分析;单独效应分析选用单因素方差分析及单组重复测量资料方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Bcl-2 mRNA转录水平比较结果 正常组及假手术组各亚组组间差异均无统计学意义;模型组及电针组各亚组与正常组及假手术组相同时间点各亚组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);电针组与模型组各相同时间点亚组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。正常组、假手术组及模型组各亚组组内差异均无统计学意义;电针组各亚组组内差异具有统计学意义(P＜0.01),以术后12 h亚组Bcl-2 mRNA转录水平相对较高,见表1。

2.2 各组大鼠caspase-3蛋白表达水平比较结果 正常组及假手术组各亚组组间差异均无统计学意义;模型组及电针组各亚组与正常组及假手术组相同时间点各亚组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);电针组与模型组各相同时间点亚组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。正常组、假手术组及模型组各亚组组内差异均无统计学意义;电针组各亚组组内(除12 h和24 h亚组之间外)差异有统计学意义(P＜0.01),以术后24 h亚组caspase-3蛋白表达水平相对较低,见表2。

3 讨论

在有效时间内采取合适的治疗可抑制缺血半暗带神经元凋亡。电针治疗脑梗死的疗效已得到肯定[4],有学者认为急性期疗效优于恢复期和后遗症期[5]。但亦有研究表明急性期开始电针治疗并非越早越好,可能存在一个最佳的治疗时间窗[6],但何时为最佳时间窗尚无定论。

caspase-3是最关键的凋亡执行蛋白酶,在缺血性脑梗死中抑制caspase-3活性可明显的减少神经元的凋亡[7]。本研究采用免疫组织化学法检测caspase-3的表达,发现电针组caspase-3的表达在各时间点均低于模型组,且24 h亚组表达最低。

细胞凋亡是由多个基因参与调控的非炎症性死亡,目前认为Bcl-2是与脑缺血神经元凋亡关系最密切的内源性凋亡抑制基因,它所编码的膜相关蛋白是一种强有力的细胞死亡抑制因子。Bcl-2可能通过干扰Ca2+释放,阻止线粒体细胞色素C释放,抗氧化抑制自由基产生等机制发挥抗凋亡作用。研究表明,Bcl-2可在大鼠脑缺血过程中广泛表达[8],且其过度表达可引起细胞核谷胱苷肽的积聚,导致核内氧化还原平衡的改变,降低caspase的活性。本研究结果显示,电针组Bcl-2 mRNA的转录水平在各时间点均高于模型组,且12 h亚组转录水平最高。

表1 各组大鼠脑梗死灶Bcl-2 mRNA转录水平比较(±s)

表1 各组大鼠脑梗死灶Bcl-2 mRNA转录水平比较(±s)

与相同时间点电针组各亚组比较,①P＜0.05;与相同时间点模型组各亚组比较,②P＜0.05

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表2 各组大鼠脑梗死灶caspase-3蛋白表达水平比较(±s)

表2 各组大鼠脑梗死灶caspase-3蛋白表达水平比较(±s)

与相同时间点电针组各亚组比较,①P＜0.05;与相同时间点模型组各亚组比较,②P＜0.05

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笔者推断电针可能通过促进凋亡抑制因子的表达并且抑制促凋亡因子的表达来减少缺血半暗带神经元的凋亡,发挥其神经保护作用。其作用机制可能与抑制脑梗死后caspase-3蛋白的表达,刺激Bcl-2 mRNA的转录有关。此外,电针促进脑梗死后康复的机制还有改善局部微循环和代谢,维持细胞内外离子稳态,对抗自由基损伤及脂质过氧化反应,调控神经递质等[9]。笔者推测电针治疗脑梗死于急性期开始疗效最好,且在其急性期存在一个最佳的治疗时间窗。

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