丁苯肽对慢性低灌注大鼠血-脑脊液屏障保护作用的研究

魏微,张微微,王娟,李蓓蓓

1.北京军区总医院神经内科,北京100700;2.第三军医大学,重庆400038

血-脑脊液屏障(blood brain barrier,BBB)由内皮细胞、基底膜、星形胶质细胞的足突和周细胞、小胶质细胞以及维持脑组织完整性的细胞外基质构成,是神经血管单元的核心结构[1,2]。在慢性低灌注状态下,BBB渗透性增加。本研究通过观察长期慢性低灌注大鼠BBB通透性的改变及给予丁苯肽干预后BBB通透性改变,以探讨丁苯肽脑保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:成年雄性SPF级Wist-ar大鼠144只,体质量250～300 g,由军事医学科学院提供[动物合格证编号:SCXK-(军)2007-004]。②主要试剂与材料:丁苯肽注射液(购于石药集团股份有限公司);伊文思蓝(购于北京化学试剂公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及干预 雄性Wistar大鼠144只随机分为假手术组、缺血组、丁苯肽组,各48只,每组大鼠按时间点分为缺血后7 d、14 d、30 d、60 d 亚组。戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,仰卧位固定,颈正中切口切开皮肤,剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸锁乳突肌,暴露颈总、颈内、颈外动脉,并分离颈总动脉和迷走神经。缺血组与丁苯肽组大鼠结扎颈总动脉,假手术组不结扎,缝合皮肤。术后大鼠均在同条件的层流动物室饲养(共死亡大鼠14只,按需补足只数)。丁苯肽组大鼠每天腹腔注射丁苯肽注射液2 mg/kg,缺血组及假手术组大鼠每天腹腔注射生理盐水1 mL,共7 d。

1.2.2 脑组织伊文思蓝含量检测 缺血后各时间点尾静脉注射2%伊文思蓝3 mL/kg后处死大鼠,取脑前用生理盐水灌注大鼠,以清除血液中染料。取脑后称重,加入2倍体积的二甲基甲酰胺,50℃水浴中孵育72 h,震荡混匀后15000 rpm离心20 min,取上清,加入3 mL纯乙酸,荧光分光光度计测定伊文思蓝分光光度值,激发波长620 nm,发射波长680 nm。以荧光分光光度值代表大鼠脑组织伊文思蓝含量。

1.2.3 伊文思蓝染色 腹腔注射麻醉大鼠,打开胸腔,经左心室穿刺入升主动脉快速灌注2%伊文思蓝-PBS 100 mL,随后灌注生理盐水至流出液清亮为止。取脑后置于4%多聚甲醛-PBS溶液中固定24 h,莱卡振动切片机切片 ,厚度 200 μ m,封片 ,摄片 。

1.3 统计学处理 SPSS 15.0软件处理数据,计量资料以±s)表示,单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织伊文思蓝含量检测结果 缺血组7 d亚组大鼠脑组织伊文思蓝含量显著高于假手术组(P＜0.01),高于丁苯肽组(P＜0.05);缺血组14 d亚组大鼠脑组织伊文思蓝含量高于假手术组及丁苯肽组(P＜0.05)。缺血组30 d及60 d亚组大鼠脑组织伊文思蓝含量在各组间差异无统计学意义,见表1。

2.2 伊文思蓝染色结果 根据Paxinos-Watson大鼠解剖图谱[3],选择 Bregma-1.08 mm,Interaural 7.92 mm层面。可见假手术组BBB完整,仅侧脑室内脉络丛有少量伊文思蓝渗出,见图1A;缺血组7 d亚组可见伊文思蓝在侧脑室脉络丛、三脑室、双侧额颞皮质运动及感觉区、枕叶皮质及基底核区渗出较多,丁苯肽组在上述部位的渗出相对减少,见图1B-C;缺血组14 d亚组BBB的破坏较7 d亚组减轻,仅见基底核及枕叶皮质局部伊文思蓝渗出,丁苯肽组BBB损害相对轻;30 d后BBB破坏基本修复,侧脑室脉络丛有少量伊文思蓝渗出,丁苯肽组比缺血组修复更好;各60 d亚组BBB修复完全,同假手术组无差异。

3 讨论

BBB是存在于脑组织与血液之间的一个复杂的细胞系统,内皮细胞依靠紧密连接构成一个连续密封的网,是大分子物质经内皮细胞间转运的屏障,其破坏将导致血浆成分外渗和水肿形成。伊文思蓝是一种偶氮基荧光染料,能与血清蛋白结合,属于大分子染色剂,正常情况下血管内的伊文思蓝不能透过BBB进入脑组织,但在BBB受损时,部分伊文思蓝可以通过血管内皮等结构渗入脑组织,按照Uyama[4]的方法,可以通过渗出血管外的伊文思蓝的量来评价BBB的通透性,这是目前评价BBB通透性的经典方法。

慢性低灌注后有BBB的破坏,但较缺血损伤时轻,可能与基质金属蛋白酶降解细胞外基质有关。本研究发现,BBB在慢性低灌注后 7 d损伤较重,与 Tomimoto等[5-7]及Tsuchiya等[8,9]的研究一致。缺血后期有胶原增生,基底膜修复。伊文思蓝染色结果显示30 d后BBB开始修复,60 d后恢复正常。BBB的修复的具体机制不详,可能与基质金属蛋白酶及其抑制因子之间的综合作用有关[3-7,5-9]。

表1 各组大鼠不同时间点脑组织伊文思蓝染色荧光分光光度值比较(±s)

表1 各组大鼠不同时间点脑组织伊文思蓝染色荧光分光光度值比较(±s)

与丁苯肽组比较,①P＜0.05;与假手术组比较,②P＜0.05,③P＜0.01

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图1 A-C 假手术组(A)、缺血组7 d亚组(B)及丁苯肽组7 d亚组(C)大鼠脑组织伊文思蓝染色结果

丁苯酞是一种新型抗脑缺血药物,可通过解除微血管痉挛、抑制血小板聚集、抑制TXA2的合成等多个环节阻断脑缺血引起的病理生理发展过程[10,11]。本研究发现丁苯肽组7 d及14 d亚组BBB的渗透性增高程度均较缺血组减轻。30 d后BBB破坏基本修复,丁苯肽组比缺血组修复更好。作为BBB的重要部分,内皮细胞在缺血缺氧损害过程中,线粒体功能受损,影响细胞能量代谢,紧密连接增宽,细胞水肿,是血管源性水肿的基础。研究表明,丁苯酞通过改善线粒体膜流动性,恢复线粒体膜电位,提高线粒体磷酸腺苷酶及复合酶IV的活性,增加超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶的活性,从而保护线粒体[12,13]。其对内皮细胞线粒体的保护作用可能是其对BBB保护作用的基础。另外,丁苯肽通过对细胞炎性因子的抑制作用可能影响基质金属蛋白酶对细胞外基质的降解,在保护BBB中也可能发挥了重要作用。

每一个神经元都有相应的毛细血管,BBB病变,通过BBB物质转运能力下降,对神经毒性物质的清除能力减弱。BBB是神经血管单元的各种组织成分交互作用的基础,任何部分损伤都可以影响其它成员。保护神经血管单元是缺血性损伤更现实的治疗靶点[10]。脑慢性低灌注特点是脑缺血时间长,没有发生缺血再灌注,脑部始终处于低灌注状态。本研究显示丁苯肽对慢性低灌注神经血管单元有保护性的作用,期望为临床上与慢性低灌注相关的轻度认知功能障碍的防治提供新的研究思路。

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