胃癌表达EpCAM和CK19临床意义的研究

侯睿哲,彭云香,毛静涛,侯治富*

(1.吉林大学白求恩医学院,吉林 长春130021;2.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春130033;3.北京龙迈达科技有限公司,北京 100176)

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,也是全世界范围内恶性肿瘤死亡的主要原因之一,早期诊断和早期治疗对胃癌预后具有很大影响。其生物标志一直是人们关注和研究的热点[1]。有文献表明,CK19可以预测早期胃癌[2]。我们通过组织芯片技术,采用免疫组织化学方法,研究 EpCAM和CK19[3-4]表达的临床意义,探讨其在早期胃癌的诊断与预后评价中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

从北京龙迈达科技有限公司的标本组织库中选取临床诊断,术后病理诊断明确的良性病变7例、胃癌31例为实验组,所有病例术前均未接受化疗或放疗。随机取正常胃黏膜16例为正常对照组。

1.2 试剂

即用型鼠抗人细胞角蛋白19(CK19)单克隆抗体、通用型SP试剂盒、浓缩型DAB试剂盒等由北京中杉金桥生物技术有限公司生产;过碘酸、伊红、苏木素染液、中性树胶卦片剂等由本实验室提供。即用型鼠抗人EpCAM单克隆抗体(ABIN 180642)购于Antibodies-online。

1.3 方法

1.3.1 石蜡包埋标本的准备 福尔马林常规固定24 h,系列酒精脱水,石蜡包埋,获得石蜡包埋组织。

1.3.2 常规切片、HE染色,镜下进行再次诊断,并定位;对于有异议的病例去除或再行免疫组化诊断。

1.3.3 组织芯片制作 选取准备的组织标本,选用2 mm芯片针,以组织芯片仪,在组织标本蜡块上再行取材,然后,按照预先做好的组织芯片设计,将所需病例数目,在模板蜡块中进行组织列阵,完成组织芯片一张为7×8的组织蜡块的制作。

1.3.4 将组织芯片蜡块进行连续切片,厚度是4 μ m,40℃裱片(玻片经过0.1%多聚赖氨酸防脱片处理),56℃烤片3 h后移到37℃恒温箱中过夜,常温保存备用。

1.3.5 免疫组化染色及结果判定 ①脱蜡:组织芯片之切片置于二甲苯中浸泡20 min,换新鲜二甲苯重复一次。②再水化:将脱腊后的组织切片于100%乙醇中浸泡5 min×2次,95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水各浸泡5 min。③抗原修复:抗原修复液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,将抗原修复液微波高火加热至沸腾,将切片放入,再用微波高火加热5 min,补加蒸馏水恢复体积后再用微波高火加热5分钟,自然冷却至室温。④去除内源性过氧化物酶:新鲜配置3%H2O2滴片,室温下避光孵育10 min;PBS洗5 min。⑤封闭:用10%正常羊血清,室温封闭10min。⑥一抗反应:滴片,分别加1∶100抗人上皮细胞角蛋白19(CK19)单克隆抗体及抗人上皮细胞粘附分子(EpCAM)单克隆抗体;10%正常羊血清作为实验阴性对照(以PBS稀释),4℃过夜反应;PBS洗5 min,共3次,不时晃动。⑦二抗反应和显色:按照Dakocytomation Envision+TM System HRP试剂盒的说明书进行。⑧最后苏木精复染细胞核,中性树胶封片后,光学显微镜下观察并记录结果,比较两种抗体对上皮来源的肿瘤细胞的特异性染色情况。

结果判定:CK19和EpCAM的表达部位分别在细胞胞浆和细胞胞膜,有棕黄色颗粒沉着。400倍光镜至少观察5个视野,阳性细胞＜5%为阴性、5%-25%为+、26%-50%为++、＞51%为+++。每批染色均设已知阳性对照。

1.3.6 数据处理 应用SPSS10.0统计分析软件,实验结果进行 χ2检验和真实性分析。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 CK19和EpCAM表达分析

用免疫组化方法,对16例正常组织、7例良性病变和31例胃癌中CK19和EpCAM的表达检测结果表明,良性病变组织、胃癌组织中CK19和EpCAM的表达均显著高于正常组织对照组。经spearman等级相关卡方检验P＜0.05,如表1所示。

表1 正常、良性病变和癌组织中 CK19、EpCAM的表达

2.2 对CK19和EpC AM在胃癌诊断试验中的评价

以胃癌组织的术后病理诊断为金标准分别做CK19、EpCAM 、串联实验(CK19 阳性 、EpCAM 阳性为阳性,其余均为阴性)和并联实验(CK19阴性、Ep-CAM阴性为阴性,其余均为阳性)在胃癌诊断试验中的真实性评价,结果如表2所示。

表2 CK19、EpCAM及其联合实验在胃癌诊断实验中的真实性评价

由此可知,在胃癌的诊断实验中灵敏度最高的为CK19和EpCAM的并联实验,特异度最高的是Ep-CAM实验,但在排除患病率的影响时EpCAM实验的诊断价值更高,且它是符合率和约登指数最高的诊断实验,所以从胃癌的循证诊断真实性评价方面来看EpCAM实验是最好的。

3 讨论

肿瘤标志物(tumor markers,TM)的检测与应用倍受人们关注,在早期诊断和早期治疗中起着重要作用。国内目前把肿瘤标志物C12检测系统广泛应用于临床,在胃癌的诊断中,贡献率最高的是CA19-9(20.51%)、CA242(19.87%)、CEA(17.31%)等[3],也有学者提出CK19检测有一定价值[4,5],但仍不理想。本实验试图探讨CK19和EpCAM对胃癌早期诊断的意义。结果表明,良性病变组织、胃癌组织中CK19和EpCAM的表达均显著高于正常组织对照组,经spearman等级相关卡方检验P＜0.05。提示对CK19和EpCAM的表达的监测,可以帮助早期诊断。我们进一步通过监测方法的真实性分析显示,在胃癌的诊断实验中可以用灵敏度比较高的CK19和EpCAM的并联实验来做初筛实验,然后以特异度比较高的EpCAM染色结果进行第二次初筛,有利于降低胃癌的漏诊和误诊率。经过诊断试验的正确性和精确性检验,本研究的CK19和EpCAM可以作为一种新的检测指标。同时证实了组织芯片技术的高通量、大样本、本底一致等优点,可以在临床推广使用。

[1]Lordick FJ,ger D.Current Status and Future of Chemotherapy and Biochemotherapy in Gastroesophageal Cancers[J].Gastrointest Cancer Res,2008,2(4):187.

[2]Kim MA,Lee HS,Yang HK et al.Cytokeratin expression profile in gastric carcinomas[J].Human pathology,2004,35(5):576-581.

[3]杨雪琴,陈 创,候晋轩,等.多肿瘤标志物C12检测系统在胃癌诊断中的价值分析[J].中国肿瘤临床,2008,35(4):184.

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[5]岳 欣,马 杰,王家仓.逆转录聚合酶链反应法检测胃癌患者外周血细胞角蛋白19表达[J].中国综合临床,2005,21(1):68.