枸杞多糖增强效应T细胞增殖和杀瘤活性机制的研究

王晓华，单铁英，侯永超，杨书良

(1.河北工程大学医学院 a生物学教研组；b人体解剖学与组织胚胎学教研组；c病理学教研室，河北 邯郸056002；2.邯郸市第一医院肿瘤内科)

以免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗是重要的肿瘤辅助治疗方法[1]。在肿瘤生物治疗中应用增强抗肿瘤细胞活性的物质，是提高疗效的有效途径。研究表明许多中药或其有效成分具有多方面的免疫调节活性，能够增强免疫活性细胞的功能[2]。目前国内有关枸杞多糖可增强免疫系统的能力从而产生抗肿瘤作用方面的报道很多，但是其具体的机制尚不明确，本研究观察了枸杞多糖(lycium bararum polysaccharides，LBPs)在树突状细胞成熟及T细胞的激活、增殖和杀瘤过程中的作用。为进一步研究LBPs调节特异性免疫应答的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜人外周血，购自北京市血库。淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂。rhGM-CSF、rhIL-2和rhIL-4，购自德国R&D公司。尼龙毛购自FENWAL USA。鼠抗人MHC-Ⅱ、CD86、CD83，即用型二步法生物素检测试剂盒(PV9000)、FITC标记的第II抗体工作液购自北京中山生物技术有限公司。枸杞多糖购自美国泛华公司。

1.2 方法

1.2.1 未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell，imDC)的培养：取正常人新鲜外周血200ml，以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞并培养2 h，取贴壁细胞即单核细胞，加入 10%胎牛血清、rhGMCSF1000 U/m l、rhIL-4 500 U/m l继续培养 7天即为imDC。

1.2.2 肿瘤细胞全抗原致敏imDC并培养为成熟树突状细胞(Mature Dendritic Cell，mDC)：常规培养肝癌细胞株Bel-7402，收集处于对数生长期的细胞并反复冻融(-80℃/室温)4次作为肿瘤细胞全抗原。将imDC调整细胞浓度至1×106个细胞/m l，加入肿瘤细胞全抗原0.2m l培养2天，即肿瘤细胞全抗原致敏的imDC。分为两组：实验组：加入终浓度100 μg/m lLBPs；对照组：加入等量的 RPMI-1640；两组分别同时作用48h后。观察DC的形态变化及其表面标志的表达。

1.2.3 T细胞的获得：按上述获得单核细胞的方法，收集非贴壁细胞即为淋巴细胞，将3×107/m l的淋巴细胞注入尼龙毛柱，静置1 h。用培养液洗柱，洗下的即为T细胞，加入rhIL-2 500 U/m l培养待用。1.2.4 T细胞的激活和增殖：悬浮上述T细胞为2×105个/100μl，放入96孔板，作为反应细胞。mDCs作为刺激细胞。调整mDC浓度2×103个/孔、1×104个/孔、2×104个/孔分别与T细胞混合，分两组 ：实验组 ：加入终浓度 100 μg/m lLBPs；对照组 ：加入等量的RPMI-1640；用MTT法测各孔的OD值。

增值指数为：实验组OD值-反应细胞对照组OD值-刺激细胞对照组OD值/反应细胞对照组OD值。

1.2.5 效应T细胞杀伤肿瘤细胞 将按上述方法获得的两组T细胞(T细胞+DC+LBPs、T 细胞+DC+

2.3 T细胞杀伤肿瘤细胞 通过MTT法检测肿瘤细胞活力的影响，来表明肿瘤细胞的杀伤情况：在培养液中有LBPs存在时效应T细胞杀伤肝癌细胞能力增强，而对MG-63细胞不能有效地杀伤(P＜0.05)。未经mDC刺激的T细胞作为对照，由于缺乏mDC的抗原呈递和刺激作用，T细胞不具有特异性杀伤肿瘤细胞的能力(表3)。RPMI-1640)，新鲜分离的T细胞作为对照。三组作为效应细胞置96孔板中，分别以人肝癌细胞Bel-7402和人骨肉瘤细胞MG-63作为阳性和阴性靶细胞，效靶比为30：1。用MTT法测各孔的OD值。

T细胞杀伤活性：靶细胞对照组OD值-实验组OD值-效应细胞OD值/靶细胞对照组OD值。

1.2.6 数据处理 所得数据经SPSS11.0软件进行处理，结果采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 单核细胞在培养过程中，可见细胞体积逐渐增大，细胞形态逐渐由圆形变为逗点状、蝌蚪状、长梭形或不规则形，并向四周伸出不规则状的突起。

免疫细胞化学检测：imDC细胞表面MHC-Ⅱweak+、CD86weak+、CD83weak+。经 LBPs诱导培养2 d后的DC的表面标志及蛋白表达发生变化：MHCII+、CD86+、CD83+，阴性对照无阳性信号。而经RPMI-1640培养的mDC分子表达与培养前无明显变化。对照组与实验组培养的DC的分子表达图像分析(表1)。

2.2 T细胞增殖实验结果 通过MTT法检测LBPs对T细胞活力的影响，来表明T细胞的增殖情况：培养液中LBPs有时DC激发T细胞增殖的能力进一步增强(P＜0.05)(表2)。且在此浓度范围内随着DCs浓度的增加T细胞的增殖率也增加。

表1 实验组和对照组培养2天后的树突状细胞表面分子表达的图像分析结果(¯x±s)

表2 T细胞增殖率(¯x±s，n=10)

表3 效应T细胞杀伤实验(¯x±s，n=10)

3 讨论

枸杞多糖是传统中药材枸杞的主要成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6种单糖组成，具有广谱防癌抗癌和调节免疫功能的作用[6]。

DC是一种重要的专职抗原提呈细胞，对启动辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的免疫应答具有重要作[7-9]。imDC俘获和处理外源性抗原后为mDC，通过主要组织相容性复合物(MHC)分子提呈抗原多肽和共刺激分子来激活T细胞，启动特异性免疫应答。实验证明，DC的成熟状态与其功能有关：imDC有较强的抗原摄取和加工能力，同时低表达MHC-II、CD86、CD83。mDC摄取抗原功能下降，但是MHCII、CD86、CD83分子高表达。这些分子正是与DC抗原提呈作用密切相关的分子，也是与DC对T细胞的激活作用密切相关的分子。我们发现DC经过LBPs刺激作用后，MHC-II、CD86、CD83的表达增高，同时混合淋巴细胞反应也证实，经LBPs培养后DC激活T细胞能力及T细胞增殖能力都增强。这些都说明LBPs诱导DC成熟，同时刺激T细胞增殖能力增强。

经肝癌细胞抗原致敏imDC并培养为mDC激活的T细胞能特异性的杀伤肝癌细胞，而培养液中有LBPs存在时效应T细胞杀伤肝癌细胞的能力进一步增强。对MG-63细胞因为不能有效地识别所以不能杀伤。

有研究表明，适量的枸杞多糖能增加T细胞IL-2受体的表达量，枸杞多糖对T细胞活性的增强作用可能通过增加IL-2R的表达量协同IL-2对T细胞的刺激作用，提示枸杞多糖对T细胞活性的增强效应部分与促进IL-2R的表达有关[10]。研究发现枸杞多糖对免疫活性细胞无直接刺激作用，DC表面存在多糖受体，枸杞多糖可与DC表面存在的多糖受体结合[11]，启动和活化DC使其分泌细胞活性因子，活化的DC及其释放的活性因子的间接作用促进T细胞等免疫活性细胞的功能；同时，T细胞被IL-2等第一信号活化后也可表达多糖受体，与多糖类物质结合而产生协同效应。这些都表明在培养液中有LBPs存在时效应T细胞杀伤肿瘤细胞的能力增强。

本研究只是通过上述几种实验证明枸杞多糖能促进树突状细胞成熟和增强效应T细胞的增殖和杀伤肿瘤的活性。但其具体的分子生物学机制尚需进一步的研究。

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