Y染色体微缺失与男性无精少精的相关关系

叶长烂,江悦华,王 捷,张中芬,吴小丽,郑 霖

(广州军区广州总医院医学实验科,广州510010)

男性不育是一种常见疾病。影响男性不育的因素有很多,其中Y染色体微缺失是其中一个重要致病因素。Yq11.23上含有与精子发生相关的基因,称为无精子因子(AZF),分为 AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四个区域,上述区域缺失或点突变会导致男性不育。本研究采用多重PCR法,对男性不育患者进行Y染色体AZF检测,分析AZF与男性不育的相关关系,为男性无精、少精的临床治疗提供重要依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2006年1月-2008年1月来我院就诊的无精少精男性不育患者151例,其中无精症患者 25例,少精症126例(注:无精症、少精症诊断按WHO精液常规分析标准),患者年龄24岁-51岁,平均33岁。40例正常生育男性为对照组。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA提取 抽取患者外周血2 ml,肝素锂抗凝,利用全血DNA快速提取试剂盒(深圳亚能生物技术有限公司)从抗凝全血中提取基因组DNA。

1.2.2 引物 由深圳亚能生物技术有限公司合成,共有15对引物和一对内控引物,组成4套PCR多重系统。具体位点及相应区域见表1。

表1 AZF PCR引物位点及扩增片断大小

1.2.3 PCR扩增 试剂由深圳亚能生物技术有限公司提供:取加入了PCR反应液Ⅰ-Ⅳ各14 μ l PCR反应管四支,在管壁上做好标记,而后分别加入已提取的样本 DNA 4 μ l(约 0.15 μ g),加入无菌水至 25 μ l反应总体系。每次检测都应同时设立一组阳性对照(正常男性基因组DNA)及阴性对照(女性基因组DNA)。按以下条件进行扩增:50℃10 min;95℃15 min;94℃30 s,58℃60 s,72℃60 s,34 cycles;72℃10 min。

1.2.4 电泳检测 取 10 μ l PCR产物加 2 μ l 6×上样缓冲液混合均匀后经2%琼脂糖电泳,在紫外灯下观察结果,使用BIO-RAD凝胶成像系统成像。

2 结果

40例正常男性基因皆未发现AZF缺失,见图1。受检的151例无精少精患者中,共检出AZF缺失8例,总缺失率为5.3%,见表2。其中25例无精症不育患者中,AZF缺失3例,缺失率为12%,皆为AZFc全部缺失(SY254、SY242、SY255、SY239 全部缺失)+AZFd部分缺失(SY152缺失),见图2;126例少精症不育患者,AZF缺失5例,缺失率为4.0%,其中4例为AZFc全部缺失(SY254、SY242、SY255、SY239 全部缺失)+AZFd部分缺失(SY152缺失),1例AZFb部分缺失(SY143缺失)+AZFd部分缺失(SY152缺失),见图3。

3 讨论

图1 正常男性AZF电泳图

表2 患者组Y染色体微缺失情况

图2 AZFc+AZFd缺失

图3 AZFb+AZFd缺失

据WHO统计,育龄夫妇中有10%-15%不育,其中男方因素占40%-50%,而与遗传因素相关的男性不育患者约占30%[1],其中Y染色体微缺失是除Klinefelter's综合征外导致男性不育的第二大原因[2]。早在1976年,Tiepolo等首次报道了人类Y染色体长臂1区1带(Yq11)存在着精子生成基因或基因家族——AZF家族,到目前为止,已发现Y染色体长臂内至少存在4个互不重叠区域与精子发生有关,即 AZFa、AZFb、AZFc、AZFd 四个区域 ,各区域内又包括若干AZF侯选基因,其缺失或点突变可引起精子异常,导致男性不育。

根据所选取不育患者范围的不同,Y染色体微缺失发生率为1%-55%[3]。本研究151例无精少精患者中,发现8例Y染色体微缺失,缺失率为5.3%,其中25例无精症患者中,检出AZF缺失3例,缺失率为12%;126例少精症患者,AZF缺失5例,缺失率为4.0%.。在检出的AZF缺失中,AZFc和AZFd为缺失热区,8例AZF缺失中皆检出有AZFd的SY152缺失;AZFc全部缺失者(SY254、SY242、SY255、SY239全部缺失)有7例,另外有1例AZFb部分缺失(SY143缺失)。本研究共检出3个AZF区域位点、两种类型缺失,即AZFc全部缺失+AZFd部分缺失、AZFb部分缺失+AZFd部分缺失,皆为联合位点缺失,未检出单独的AZFc缺失,未发现AZFa缺失。在本组研究中,AZF缺失率为5.3%,与文献综合报道的1%-55%相比缺失偏低,这可能是由于:①精子发生是一个多阶段的复杂过程,涉及与细胞分裂、分化和发育等过程有关的许多结构或功能基因,除Y染色体外有其它一些遗传因素及未知生精调节基因异常;②不同地区、种族间可能存在差异;③可能还存在其他几类缺失机制,目前尚未明确,需深入研究Y染色体微缺失的分子机制[4]。

研究表明,Y染色体微缺失是由于基因重所组造成,这与Y染色体上有大量高度重复和回文序列有关[5]。Y染色体微缺失和表型的关系如下:AZFa缺失不常见,与唯支持细胞综合征(Scos)有关;AZFb缺失时精子发生常阻滞于精母细胞阶段;AZFc缺失最常见,精子数目变化大,可从正常的精子数量至无精子[6]。Y染色体微缺失可以从正常的带缺失的精子传递下来,也可以通过正常精子受精后在胚胎发育过程中发生Y染色体缺缺失,另外,现代人工辅助生育技术也可能将Y染色体微缺失遗传下去,导致子代不育。由于AZFc缺失精子有进行性下降的趋势,部分患者最后发展为无精子症因此,对男性不育患者尤其是无精症、少精症患者进行AZF检测,找到精子生成障碍的真正原因,具有非常重要的临床意义。

[1]Hopps CV,Mielnik A,Goldstdein M,et al.Detection of spem in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa.AZFb.and AZFc regions[J].Hum repord,2003,18(8):1660.

[2]Lanfranco F,Kamischke A,Zitzmann M,et al.Klinfelter's syndrome[J].Lancet,2004,364(9430):273.

[3]Dada R,Gupta NP,Kucheria K.J Yq microdeletions-azoosermia factor candidate genes and sper matogenic arrest[J].Biomol Tech,2004,15(3):176.

[4]刘祥印,薛百功,刘睿智,等.男性不育患者Y染色体AZF区微缺失分析[J].吉林大学学报(医学版),2008,34(2):305.

[5]项云改,谭 丽.Y染色体微缺失与男性不育.国外医学·计划生育/生殖健康分册,2007,26(1):5.

[6]崔英霞,李宏军,黄宇烽.男性不育的遗传学改变及可能对策[J].中华男科学,2003,9(6):462.