miRNAsiRNAs在精子发生过程中的重要作用

赵峥辉林胜利赵连明吴银玲综述 葛少钦, 4, 5, 6审校 . 河北大学医学部（保定 0700）; . 北京大学第三医院生殖医学中心; . 北京大学第三医院泌尿外科; 4. 河北大学生殖医学研究所; 5. 河北大学附属医院生殖医学科; 6. 河北省计划生育科学技术研究院

miRNAsiRNAs在精子发生过程中的重要作用

赵峥辉1林胜利2赵连明3吴银玲1综述 葛少钦1, 4, 5, 6审校
1 . 河北大学医学部（保定 071002）; 2. 北京大学第三医院生殖医学中心; 3. 北京大学第三医院泌尿外科; 4. 河北大学生殖医学研究所; 5. 河北大学附属医院生殖医学科; 6. 河北省计划生育科学技术研究院

精子发生是一个高度调控的转录、翻译和翻译后过程[1]。精原干细胞在婴儿出生后就开始了其分化过程：经过精原细胞有丝分裂和精母细胞减数分裂之后，所形成的单倍体圆形精子细胞通过精蛋白替代组蛋白完成染色质浓缩和细胞核重塑过程，最终形成了具有特定表观遗传修饰的成熟精子[2]。近期的研究表明，虽然人类基因组广泛转录，但大部分RNAs没有翻译成蛋白质。这些被称作非编码RNAs （ncRNAs）的转录产物大小不一，是基因表达调控的重要表观遗传因子。ncRNAs调控精子发生过程主要在转录、转录后和表观遗传等水平调控基因表达，转录水平通过改变染色体构象的方式调节基因表达；转录后水平通过使mRNA裂解或翻译抑制行使其功能；表观遗传水平则是通过与其它表观遗传因子相互作用调控基因表达[3]。

根据生物学功能可将ncRNAs分为“管家ncRNAs （house-keeping ncRNAs）和调控性ncRNAs：管家ncRNAs主要包括核糖体RNA（rRNA）、转运RNA （tRNA）、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA （snoRNA）、不均一核RNA（hnRNA）、引导RNA （gRNA）和端粒酶RNA[4]；调控性ncRNAs主要包括微小RNA（miRNA）、小干扰RNA（siRNA）、piRNA、长链非编码RNA (lncRNA)、信号识别颗粒RNA（srpRNA）、反义RNA（atRNA）、tmRNA和从内含子或DNA非编码区转录的eRNA。不同种类的ncRNAs可单独或协同作用完成某些生命活动，其中miRNA途径是基因表达调控的重要机制之一。精子发生过程中，miRNAs呈阶段特异性表达，在精原细胞向粗线期精母细胞转变过程中，有32种miRNAs表达上调，78种miRNAs表达下调；而在粗线期精母细胞向圆形精子细胞转变过程中，有144种miRNAs表达上调，29种miRNAs表达下调，表明这些miRNAs逐步参与精子发生的整个过程[5]。miRNAs异常表达会影响男性的生育能力，如缺乏合成miRNAs所需的Dicer酶，会导致miRNAs整体缺失，对男性生育能力产生决定性的影响[6]。通过阐述miRNAs的最新研究进展，分析其在精子发生和男性生育中的重要调控作用，可为不育症的诊断与治疗提供基础资料。

一、miRNAsiRNAs的产生与调控

miRNAs为长度21～25个核苷酸不等的内源性RNAs，是蛋白质编码基因表达的重要调节因子之一。研究发现，miRNAs的编码序列贯穿于整个基因组，大约有1000个基因，其中约一半位于内含子，miRNAs的转录产物由其编码序列之后的一个宿主基因所调控[7]。绝大多数miRNAs编码序列需先在RNAPol Ⅱ作用下转录成pri-miRNAs，然后primiRNAs在双链RNA核酸内切酶Drosha和DGCR8催化下裂解成pre-miRNAs，pre-miRNAs由核内转运到胞浆，被核糖核酸内切酶Dicer裂解生成成熟的miRNAs[8]。随后miRNAs解螺旋，与AGO蛋白和其它辅助蛋白结合形成miRNA诱发沉默复合体（MiRNA-induced silencing complex, miRISC）[9]。此复合体中，miRNAs通过碱基互补配对与靶mRNAs结合形成双链RNA，使序列特异性识别的靶mRNAs降解或翻译抑制[10]。降解或翻译抑制的程度取决于靶mRNAs与miRNAs的互补程度和miRISC中AGO蛋白的类型[11]。

哺乳动物中，AGO2是唯一可以裂解RNA的AGO蛋白，其与高度互补的miRNA-mRNA协同作用，导致RNA裂解[12]。然而，如果miRNA与靶mRNA未完全互补，可能会将mRNA隔离在胞质颗粒中，伴有或不伴有翻译抑制[13]。Wakiyama等[14]研究发现，miRNAs可以使靶mRNAs的多聚A尾脱腺苷化，避免与多聚A绑定蛋白结合，进而抑制翻译过程。此外，AGO2还可与真核细胞翻译起始因子4D（Eukaryotic translation initiation factor 4D, eIF4D）竞争性结合修饰的mRNAs5’末端，阻止翻译过程[15]。另一方面，miRNAs也可促进翻译过程，取决于细胞增殖的状态和靶mRNAs 3’UTR中AU富集的程度[16]。一个miRNA可有数百个靶mRNAs，而一个mRNA也具有多个相同或不同的miRNA绑定位点。因此miRNAs具有强大的环行调节能力，可以调控大量不同的靶点和各种各样的生理或病理过程[17]。

二、miRNAsiRNAs与精原细胞分化

精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）位于生精上皮的基底区，在整个性成熟过程中，SSCs依靠自我更新和分裂维持干细胞池[18]。精子发生过程中，miRNAs通过翻译和传导细胞信号维持未分化干细胞总数和诱发细胞分化过程，严格调控SSCs的状态[19]。

He等[20]研究发现miR-20和miR-106a在小鼠SSCs中优先表达，对SSCs的自我更新非常重要。高通量测序技术显示miR-21, miR-34c, miR-182, miR-183和miR-146a一起表达在SSCs富集的总体中，miR-21的短暂抑制会增加生殖细胞凋亡的数量，表明miR-21 对SSCs总数的维持至关重要[21]。此外，Moritoki等[22]在大鼠隐睾病模型的研究中发现miR-135a的靶转录因子FoxO1在维持SSCs总数上也具有重要作用。Yang 等[23]研究发现X染色体miRNA群如miR-221和miR-222在未分化的精原细胞中高度表达，其功能障碍会导致精原细胞分化，表明他们在维持精原细胞未分化状态中具有重要作用。MiR-146在未分化的精原细胞中高度表达，其转录水平是分化精原细胞的180倍。

uszar等[24]研究显示用维甲酸诱导精原细胞分化会下调miR-146的表达水平，表明miR-146具有维持精原细胞未分化状态的作用。Tong等[25]研究发现敲除小鼠未分化精原细胞中优先表达的miR-17-92群基因会导致睾丸缩小和附睾精子数量减少，但会增加miR-06b-25群的表达，表明这两群miRNAs在功能上具有协同作用。另一方面，一些miRNAs也具有促进精原细胞分化的能力，如let-7家族miRNAs，Gaytan等[26]研究发现RNA绑定蛋白LIN28定位于未分化的精原细胞中，通过抑制let-7家族miRNAs的生物合成，使精原细胞总数循环扩增。

三、miRNAsiRNAs与精母细胞的减数分裂

精母细胞减数分裂过程中，转录过程的广泛进行使得哺乳动物睾丸组织中转录产物复合体高于其他组织，转录后水平上的miRNA调控机制在此过程中发挥了重要作用[27]。

在减数分裂起始阶段，miR-449群的调控水平显著上升，其表达受到转录因子CREMtau和SOX5的严密调节[28]。值得注意的是，miR-34 b/c的调控水平在miR-449敲除的睾丸组织中显著上升，而且miR-449群和miR-34 b/c共用一些靶向基因，表明他们之间存在一些功能的补偿[29]。Yu等[30]研究发现miR-34c在SCs、精母细胞和圆形精子细胞中均有表达，其不仅可以调控干细胞状态，而且在精子发生后期也具有重要作用。Liang等[31]研究发现初级精母细胞中miR-34c表达水平下调可阻止生殖细胞的T缺失诱导的凋亡（T deprivation-induced apoptosis），按照这一理论，在生殖细胞培养中，miR-34c的高度表达会导致细胞凋亡，表明miR-34c在提高确定谱系的细胞初始表型中具有重要作用。此外，研究发现X染色体miRNA家族的表达水平高于其它所有miRNAs的表达[32]，这与X染色体中miRNA基因密度明显高于常染色体并可在精母细胞中表达有关。精母细胞减数分裂时期，性染色体基因在减数分裂期性染色体钝化（meiotic sex chromosome inactivation, MSCI）过程中发生了表观遗传沉默，但miRNA家族却没受到MSCI的影响，而是通过基因复制不断扩增。这表明在进化过程中，X染色体上miRNA基因复制是选择性活化的，以使其避免MSCI在精母细胞中表达。

四、miRNAsiRNAs与精子形成

精子形成过程中，精子染色质中的组蛋白首先被过渡蛋白替代，然后再被精蛋白替代，最终完成以核小体为基础到以精蛋白为基础的染色质结构转变。精子核内染色质结构的成功转变取决于精子发生晚期过渡蛋白和精蛋白的时空特异性表达。

为保证这种准确的时空表达模式，miRNAs对过渡蛋白和精蛋白的表达在转录后水平上进行精确调控。Chang等[33]研究发现敲除Prm1Cre-Dicer1基因会导致睾丸产生头部形态异常的长型精子，且精子内染色质的完整性也受到损害，表明圆形精子中Dicer1基因失活会抑制生殖细胞转录本翻译的活化，其中就包括使转录本被翻译抑制核糖核蛋白复合体隔离的精蛋白1。粗线期精母细胞和圆形精子细胞时期，miR-469通过降解编码过渡蛋白和精蛋白的mRNAs，抑制它们的表达[34]。Yu等[35]研究发现miR-122a富集于精子形成时期的雄性生殖细胞中，通过裂解编码过渡蛋白2 的mRNAs调控其表达。此外，有研究表明，miR-13可通过增强生精细胞特异性标志物的表达来促进精子形成过程[36]，miR-888对维持成熟精子的结构和鞭毛的蠕动具有重要作用[37]。尽管减数分裂后期和单倍体生殖细胞是精子生成过程中miRNAs产生的主要根源[38]，但目前关于miRNAs对精子形成过程调控作用的报道却较少。

五、miRNAsiRNAs与男性不育

精子发生是一个复杂的细胞分化过程，精确的基因表达调控是正常精子发生的基础，任一阶段的调控错误与（或）表达缺陷都会在一定程度上影响雄（男）性生育能力或导致不育。精子发生的各阶段均存在不同程度miRNAs的表达。为探明miRNAs在不同类型精子发生过程失败中的具体作用，Yang等[39, 40]在人类正常睾丸组织中进行了miRNAs表达谱的研究，并确定了几种不同的miRNAs表达模式。此外，Jodar等[1]研究发现精子中的miRNAs可在转录或转录后水平上调控早期胚胎发育过程中的基因表达。值得注意的是miR-34c是人类精子中最丰富的miRNA，其也可在小鼠成熟精子或受精卵中检测到，这种由精子运载的miRNA是第一次卵裂所必需的[41]。表明精子中miRNAs的异常表达不仅影响男性生育能力，还会阻碍早期胚胎发育过程。此外，miR-141、miR-429和miR-7-1-3p在非梗阻性无精子症患者精浆中表达显著上升，可作为诊断该疾病的一种有效生物标志物[42]，并且来自睾丸和附睾液中的miRNAs已被证实是精子生成和成熟障碍的无创性生物标志物[43]。

六、问题与展望

遗传和表观遗传信息的成功传代有赖于精子发生过程中基因组的保护和表观遗传标记的正确建立和维持。miRNAs产生途径是基因表达和靶mRNAs结局的重要调控机制之一，研究发现拟染色体作为RNAs处理和代谢的载体，在减数分裂至精子形成阶段miRNAs的转运过程中发挥了重要作用[44]。miRNAs、miRNA相关蛋白和RNA绑定蛋白SAM68均存在于拟染色体上，SAM68通过与Drosha和Dicer相互作用调控miRNAs的表达，在miRNAs产生途径中具有重要作用[45]。精子发生过程中miRNAs表达和功能研究，有助于我们对男性生育能力进行正确评价，这对处理日益增多的男性不育疾病和满足辅助生殖技术的需要至关重要。

研究表明miRNAs存在于成熟的精子和精液中，精子发生障碍会导致其表达谱出现异常，造成男性不育，并与睾丸癌的发生有一定联系，miRNAs可作为男性不育疾病诊断和分型的潜在生物标志物。Iorio等[46]研究发现一些miRNAs可以与其它表观遗传修饰相互作用，如miRNAs可直接或间接地调控DNA甲基转移酶，影响从头甲基化和维持甲基化过程等。反之，DNA甲基化也可影响miRNAs的表达。这种调控机制可以沉默抑癌基因或激活癌基因，对肿瘤发生也具有重要作用[47, 48]，对单个miRNA或miRNA家族进行准确的功能划分，可以促进我们对男性不育与男性生殖肿瘤之间相互关系的理解。

精子发生是一个复杂的细胞分化过程，其miRNAs呈阶段特异性表达，未知领域还很多，因此，精子发生过程中miRNAs的发生、种类、功能作用，以及与其它表观遗传调控因子的相互作用关系等，尚有待于进一步深入研究。

致谢：本文由河北省自然科学基金资助项目（编号：H2013201259）；河北省2013留学回国人员科研活动项目（编号：C2013005002）；河北大学创新训练项目（编号：201410075029，201410075073）；国家第48批“留学回国人员科研启动基金”（编号：702850515001）基金项目资助

关键词微RNAs; 精子发生; 不育, 男性

参 考 文 献

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（2014-12-13收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.04.015

中图分类号R 698.2