氯化甲基汞对人SHG44胶质瘤细胞抗肿瘤活性的体外实验研究

柳 影,陈 儇,郭 杰,毕晓颖,李志超,袁长吉*

(1.吉林大学第一医院肿瘤中心,吉林长春130021;2.吉林大学公共卫生学院毒理教研室,吉林长春130021)

神经胶质瘤是颅内最为常见的原发肿瘤,脑胶质瘤治疗手术为首选,但由于脑胶质瘤具有浸润生长的特性,与脑组织间无明显边界,难以作到全部切除,目前主张综合治疗,即术后配合以放射治疗、化学治疗等。迄今为止大多数化疗药物常因不易透过血脑屏障,在临床应用中受到很大限制,因此寻找易于透过血脑屏障的有效化疗药物尤为重要。氯化甲基汞(methylmercury chloride,MMC)属于烷基汞化合物,具有抗肿瘤的多靶点细胞毒作用,具有良好的脂溶性,我们认为其具有治疗中枢神经系统肿瘤的潜能,提出用氯化甲基汞治疗脑胶质瘤的新思路,据此本文通过体外实验,研究MMC对SGH44胶质瘤细胞的杀伤、增殖和细胞凋亡/坏死的影响,为神经胶质瘤的化学治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 MMC(Merck),IMDM细胞培养基(Gib-co),四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma),胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所)。

1.2 细胞培养 SGH44胶质瘤细胞株,由吉林大学公共卫生学院放射生物重点实验室提供,在含有10%胎牛血清的 IMDM培养基中,置于 37℃、5%CO2培养箱培养,传代培养后用于实验。

1.3 MTT法比色法测定MMC对 SGH44胶质瘤细胞的增殖抑制率 移除细胞培养液,加入0.25%胰酶1分钟消化贴壁细胞,再加入10 ml细胞培养液,用滴管将细胞吹打成单细胞悬液,调整细胞浓度,以每孔1×104个SGH44胶质瘤细胞铺96孔培养板,待细胞贴壁后12 h移除培养液,分组加入含不同浓度(0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50 、5.00、10.00 μ mol·L-1)MMC 的 细 胞 培 养 液 100 μ l,在37℃、5%CO2培养箱培养72 h后,每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μ l,继续培养4 h后移除培养液。每孔加入 DMSO 150 μ l,振荡后用酶标仪(Bio-Rad Model 550,美国)570 nm测定吸光度值(A值),计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组A/对照组A值)×100%。

1.4 MTT比色法测定MMC对 SGH44胶质瘤细胞的杀伤作用 在96孔平底培养皿中每孔加入1×104SGH44胶质瘤细胞,培养72h后,在培养基中加入含有不同浓度(0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 μ mol·L-1)的MMC,分别作用 4 、8、16和32 h后,采用MTT法测定细胞吸光度值(A值)。

1.5 流式细胞仪测定MMC对人SGH44胶质瘤细胞凋亡/坏死的影响 上述细胞接种于24孔平底培养板中,每孔为1×106细胞,接触不同浓度MMC(0.075 、0.15 、0.3 和 1.2 μ mol·L-1),培养 12 h 后 ,用0.25%胰蛋白酶消化,用PBS洗涤后加入Hochest 33258 150 μ L(100 g·L-1),37°C 温育 30 min,再加入100 μ LPI(不含Triton ×100),4°C条件下避光放置30 min,Hochest 33258用氩离子激光激发,波长352 nm,PI激发波长488 nm,用FACScan流式细胞仪,收集1×104细胞,测定胶质瘤细胞凋亡坏死率,用Cellguest软件进行分析处理。

1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0 for Windows统计软件包,数据以±s表示,各组细胞存活率比较采用单因素方差分析,细胞存活率各剂量组间比较采用q检验。

2 结果

2.1 不同浓度MMC对SGH44胶质瘤细胞的增殖抑制作用

不同浓度(1.25 、2.50、5.00 和 10.00 μ mol·L-1)MMC作用72 h后,细胞存活率分别为94.2%、48.2%、39.6%和10.6%,显著低于对照组(P＜0.05),MMC对人SGH44胶质瘤细胞杀伤作用呈剂量及时间依赖性,随浓度的增加和时间的延长而增强,见表1。

表1 氯化甲基汞对SHG44胶质瘤细胞增殖的抑制作用(±s,n=3)

表1 氯化甲基汞对SHG44胶质瘤细胞增殖的抑制作用(±s,n=3)

与对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01

Group Concentration(μ mol·L-1)SHG44 viability(%)Control 0.00 100.0±4.2 MMC 0.08 91.0±20.0 0.16 118.8±4.7 0.31 128.0±6.3 0.63 101.1±21.0 1.25 94.2±8.0 2.50 48.2±8.0*5.00 39.6±1.1*10.00 10.6±2.1*

2.2 MMC对SGH44胶质瘤细胞的杀伤作用

不同浓度(2.50、5.00 和 10.00 μ mol·L-1)MMC作用于SGH44胶质瘤细胞4、8、16和32 h后细胞存活率明显低于对照组(P＜0.05),MMC对SGH44胶质瘤细胞杀伤作用呈剂量和时间依赖性,随浓度的增加和时间的延长而增强,见表2。

表2 氯化甲基汞对SHG44胶质瘤细胞的杀伤作用(±s,n=3)

表2 氯化甲基汞对SHG44胶质瘤细胞的杀伤作用(±s,n=3)

与对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01

Group Concentration(μ mol·L-1)Cell viability(%)(t/h)4 8 16 32 Control 0.00 100.0±19.7 100.0±19.1 100.0±10.4 100.0±14.3 MMC 0.16 81.8±0.4 91.6±13.5 102.0±7.1 103.5±9.3 0.31 77.9±8.2 98.6±2.9 92.6±1.4 94.8±17.6 0.62 79.5±9.7 79.8±0.6 96.3±2.8 68.3±18.5*1.25 78.4±7.9 80.9±1.5 78.6±1.3 42.6±17.3*2.50 56.9±9.9* 33.2±18.3* 57.1±4.8* 22.2±0.9*5.00 50.5±8.7* 32.1±7.2* 35.6±9.9* 20.7±2.9*10.00 15.4±2.7* 18.9±11.7* 37.2±0.9* 13.4±5.6*

2.3 MMC对SGH44胶质瘤细胞凋亡/坏死的影响

氯化甲基汞引起SGH44胶质瘤细胞凋亡/坏死率与对照组相比明显增高,接触 0.075、0.15、0.3、1.2 μ mol·L-1氯化甲基汞 12 h后细胞凋亡/坏死率呈现剂量依赖性增高趋势(P＜0.01)。结果表明,MMC可诱导SGH44胶质瘤细胞凋亡,见表3。

表3 不同剂量氯化甲基汞对SHG44细胞凋亡和细胞坏死的影响(n=6)

3 讨论

神经胶质瘤是发生在神经外胚层的肿瘤,是颅内肿瘤最常见的一种,据统计其发生率约占全部颅内肿瘤的40-50%[1],其生长呈侵袭性,手术往往难以根治,术后复发率亦较高。近年来,随着综合治疗理念的不断更新,放疗、化疗在神经胶质瘤的作用越来越重要,但即使经过综合治疗,平均生存期仍难以超过一年[2]。目前药物治疗神经胶质瘤的主要问题是许多新型化疗药物难以透过血脑屏障,使它们的应用受到限制,所以寻找一种特异性高、容易通过血脑屏障发挥抗肿瘤作用的药物成为目前肿瘤治疗领域的焦点。

氯化甲基汞为烷基汞化合物,结构式为CH3-Hg-CL,碳链短,碳汞共价结合牢固,非电离,具有良好的脂溶性,极易透过血脑屏障。Berlin等人给鼠猴(squirrel monkeys)喂饲含有放射性标记甲基汞的乳汁,探讨氯化甲基汞的神经毒性及其毒代动力学,结果表明甲基汞在脑中靶向蓄积,脑与血汞的比值为5.6,与Carlson等人报道的结果相一致[3]。

由于氯化甲基汞具有上述特殊的理化特性,进入脑组织后,与细胞和细胞内的亚细胞结构(线粒体、内质网、高尔基体和溶酶体等)的膜、胞浆、核蛋白以及核酸相互作用,从而对神经系统产生多靶点毒害细胞效应。氯化甲基汞具有类放射损伤效应,可引起DNA断裂。其烷基结构能与DNA碱基相互作用,在DNA双链内形成链内链间交联,影响DNA的正常复制[4]。氯化甲基汞也可诱导细胞凋亡/坏死,线粒体是氯化甲基汞作用的主要靶点,氯化甲基汞可抑制线粒体呼吸链复合物Ⅱ,导致不完全氧化产物ROS、自由基的生成[5],亦可影响神经元线粒体膜电位,改变其膜透性,使细胞色素C释放至胞浆并与Apaf-1结合,引起Caspase级联反应,诱导细胞凋亡/坏死[6-8]。氯化甲基汞干扰发育阶段脑神经元细胞周期进程,诱导 p21Waf1/Cip1、Gadd45、Gadd153表达,使神经元阻滞在 G0/G1、G2/M期[9,10]。

我们既往已经应用氯化甲基汞抗大鼠C6胶质瘤细胞行体外研究[11],并观察了氯化甲基汞诱导凋亡的形态学改变[12],发现MMC具有抑制大鼠C6胶质瘤增殖的作用,其机制可能是通过诱导胶质瘤细胞凋亡实现的。本实验结果表明,MMC对SGH44胶质瘤细胞增殖有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性,随着浓度的增加而增强;MMC对SGH44胶质瘤细胞杀伤作用呈剂量及时间依赖性,随浓度的增加和时间的延长而增强,并可诱导SH44胶质瘤细胞的凋亡和坏死。

综上所述,氯化甲基汞对体外培养的SGH44胶质瘤细胞具有明显的增殖抑制作用和杀伤作用,诱导细胞凋亡,提示我们氯化甲基汞是一种有潜力的新型抗胶质瘤药物,其作用机制尚待进一步研究。

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