弱精症男性精子SEMG1基因表达及对体外受精结局的影响

蔡昭炜 赵 丽 何少娟 李雪玲

1.广东省东莞市松山湖中心医院(523326)；2.广东省东莞市人民医院

弱精症是导致男性不育症的主要因素之一[1-2]，引起弱精症的病因多种多样，其发病机制仍是困扰生殖学术界的一大难题[3-4]。已有多个研究报道，男性精液中的蛋白质主要由SEMG1基因编码的蛋白构成，主要参与精液凝胶基质的构成，对射精前的精子起到固定保护作用，射精时凝胶被前列腺特异抗原PSA酶分解，使精子从基质中释放出来，这就是精子液化过程[5-6]。当SEMG1基因表达异常升高时，会造成精子液化效率低下，使精子数量和活力降低导致不育症发生[7]。本研究通过分析弱精症患者精子SEMG1基因表达及体外受精结局，探讨SEMG1基因对男性不育症中的影响，为阐明弱精症的生物学机制提供理论支持，也为弱精症的诊断标志物和男性避孕药物的开发提供新的启发。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月-2019年1月在东莞市第三人民医院生殖中心就诊的34例男性不育患者。纳入标准：①自愿签署知情同意书；②经过检查后分别确诊为患轻度弱精症、中重度弱精症及未患弱精症。排除标准：①合并性功能障碍史；②合并生殖器创伤史；③合并遗传疾病或精神疾病；④合并睾丸及输精管结扎术史。本研究通过了东莞市第三人民医院伦理委员会批准。

1.2 方法

34例患者均在禁欲2～7d后采集精液，依据WHO第5版《人类精液检查与处理的实验室手册》[8]标准检测标本，获取精液常规分析的精子浓度、总数以及前向运动精子百分率的测量值。计算机辅助精子分析系统(CASA)分析仪选用美国哈密尔顿精子质量分析仪。采用Percoll不连续梯度法处理精液，收集沉淀精子提取RNA，进一步反转录成cDNA，实时荧光定量PCR技术检测精子SEMG1基因表达，引物序列见表1。RNA提取试剂盒Maxima Reverse Transcriptase均购自德国Qiagen公司，LightCycler480型荧光定量PCR仪购自美国Roche公司。获取患者体外受精结局。

表1 引物序列

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 精子常规参数

34例年龄22～50岁，根据精子活力(PR)值分为非弱精12例(≥32%)，轻度弱精10例(20%～32%)，中重度弱精12例(0～20%)。各组精液常规参数见表2。

表2 各组精液常规参数比较

2.2 PCR检测精子SEMG1基因表达

检测结果显示，精子SEMG1的基因表达轻度弱精症组高于非弱精组，中重度弱精症高于轻度弱精症组(P<0.0001，图1)(1720页)。

2.3 免疫荧光染色检测精子SEMG1蛋白表达

结果显示，精子SEMG1蛋白表，中重度弱精症组最高，轻度弱精症次之，非弱精组最低(P<0.05，图2)(1720页)。

2.4 SEMG1表达水平与体外受精结局

分别对不同体外受精结局患者的精子SEMG1基因和蛋白表达进行分析:在基因水平，体外受精<50%的精子SEMG1表达高于体外受精≥50%的精子(P<0.0001，图3a)(1720页)；蛋白水平也同样趋势，免疫荧光结果显示，体外受精<50%的精子SEMG1的蛋白表达水平高于体外受精≥50%的精子(P<0.0001，图3b)(1720页)。

3 讨论

弱精症是导致男性不育的主要因素之一。张国晖[9]等分别从基因突变、线粒体DNA突变、miRNA调控异常以及精子端粒长度改变等4个方面，综述了目前对于弱精症发病机制的认识现状,弱精症发病机制仍需更多探索。由SEMG1基因编码的精原蛋白在附睾中高度表达，是影响射精精子凝胶包埋的主要蛋白，这些蛋白质共有的抗原表位位于精子的运动部位[10-12]。在精液液化过程中，激肽释放酶相关肽酶3(KLK3，又称前列腺特异性抗原)将精原蛋白降解为低分子量片段，凝胶溶解，精子被释放并逐渐运动[10-13]。可见SEMG1及其编码的蛋白是调控精子液化、运动和活力的因素。有研究指出，SEMG1基因有望成为诊断弱精症的潜在候选基因之一，这更加说明SEMG1基因与弱精症间具有密切的相关性。

本研究轻度弱精症男性精子SEMG1基因表达高于非弱精症男性，中重度弱精症者SEMG1基因表达最高，故认为随着弱精症病情加剧， SEMG1基因表达与病情程度成正相关，导致体外受精成功率降低，提示精子SEMG1在基因水平上调导致其蛋白表达水平的升高。此外，SEMG1蛋白也同样，弱精症较重患者其精子SEMG1蛋白表达升高，说明在蛋白水平弱精症患者精子SEMG1的表达较非弱精症者显著升高，且与病情呈正相关。郭小彬[3]等通过高表达大鼠SEMG1基因成功建立了弱精症大鼠模型；乔素冬[13]通过对比正常男性和弱精症男性发现，SEMG1基因在弱精症男性精子中表达明显上调。SEMG1基因广泛表达在射精精子中，同时在睾丸、附睾和前列腺中也有少量表达。精原蛋白1是构成精液凝胶的主要成分，凝胶状精子不具备运动活力[14-16]，当精原蛋白1与前列腺分泌的Zn2+结合后，前列腺抗原被激活进而分解凝胶精子中的精原蛋白1，产生具有抑制精子活性和抗菌活性的小分子多肽片段[11]。精子的活性与液化是影响精子获能的必要因素，是精子实现向前运动的必要条件。本研究发现与上述文献报道一致。

文献报道和本研究均发现SEMG1表达上调可导致精子运动能力下降，那么SEMG1的高表达是否会影响精子与卵子的结合成为弱精症男性不育的致病因素？本次研究分别检测了不同受精结局者精子SEMG1基因和蛋白的表达。结果表明，在体外受精受精结局<50%的精子中，SEMG1基因和蛋白的表达均高于体外受精结局≥50%的精子，说明高表达SEMG1基因的精子不仅是造成男性精子活力降低导致弱精症的因素，同时也会降低体外受精成功率，这为解释弱精症男性高发不育症提供了一定的实验室指标依据。

综上所述，弱精症男性精子SEMG1基因表达异常升高影响精子液化导致精子活力降低，进而抑制精子与卵子的结合最终造成弱精症男性不育症。这为解释弱精症的发病和治疗提供了靶点，同时也为潜在避孕节育开发靶点提供思路。