盐酸雷诺秦对豚鼠乳头肌动作电位及收缩力的影响

王国涛,张文杰,杨 萍*

(1.吉林大学中日联谊医院,吉林长春130033;2.吉林大学基础医学院生理教研室,吉林长春130031)

雷诺嗪为美国CVTheraPeuties公司开发的一种治疗心绞痛型冠心病的新型药物,用于单一和辅助治疗慢性心绞痛,已于2006年1月30日FDA批准在美国首次上市。雷诺嗦的化学名为(±)-N-(2,6-二甲基苯基)-4-[2-羟基-3-(2-甲氧苯氧基)丙基]-1-哌嗪乙酰胺,属于呱嗪类衍生物。作为一种有效的抗缺血药物,雷诺嗪早期被认为是部分脂肪酸氧化酶抑制剂,现有试验证明雷诺嗪可以防止钠超载和由钠超载引起的钙超载[1]。近年研究表明其机制可能与选择性的抑制慢钠通道有关,从而减少缺血再灌注相关的钠离子依赖的钙超载,减少心室复极化和收缩性的异常,减少缺血诱导的收缩紊乱[2]。由此推测雷诺嗪可能成为一种抗心律失常及改善心功的药物,国内外有关这方面的研究未见报道。

1 材料与方法

1.1 动物及药品 成年豚鼠18只,体重250-300 g,雌雄不限,由吉林大学实验动物中心提供。雷诺嗪ranolazine dihydrochloride分子质量500.46,购于Sigma公司。

1.2 心室肌乳头肌标本的制备 按文献方法[3,4]制备心室肌条,豚鼠击头部快速处死,开胸取出心脏,在4℃的台氏液中分离左心室肌条,将心室肌条固定于容积为5 ml的标本槽内,另一端与张力换能器相连。以pH 7.2-7.4、温度37℃的台氏液恒速灌流(3-4ml·min-1)、灌流液充以95%O2+5%CO2的混合气体。台氏液(Tyrode's solution mmol/l)的成分:NaCl 137,NaHCO312,NaH2PO4,1.8,MgCl20.5,KCl 3.0,CaCl22.0,Glucose 5.5。

1.3 心室乳头肌动作电位记录及分析[4]采用标准玻璃微电极法测心室肌动作电位的各个参数,取充以3 mol·L-1KCl的玻璃微电极(阻抗20-30 MΩ)固定在三维微操纵器(NARISHIGE,日本)上,引导动作电位。刺激电极给予波宽2 ms、1.5倍阈强度的电流刺激驱动标本,刺激频率为1 Hz。动作电位信号经微电极放大器(MEZ-7101,日本),通过BL-420(中国成都)输入计算机,分析动作电位幅度(APA),静息电位(RP),最大自动去极化速率(VMAX),动作电位复极 20、50%和 90%时程(APD20、APD50和APD90)。心室肌收缩活动通过张力换能器经BL-420输入计算机,记录乳头肌的收缩幅度和频率。

1.4 实验分组及方法 健康成年豚鼠18只,随机分为3组,每组6只。实验开始前以基础刺激频率刺激豚鼠乳头肌标本20 min,稳定后将微电极刺入心室肌细胞内,待动作电位波形稳定后记录各参数作为给药前的自身对照,然后对3组分别给予H2O2(过氧化氢)(200 μ M 模拟心律失常)、雷诺嗪(10 mmol·L-)+H2O2和TTX(河豚毒素)(2mmol·L-)+H2O2,灌流3 min后记录各项指标,实验中保持恒温、恒速灌流,保持药物浓度恒定。

1.5 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 雷诺嗪对豚鼠乳头肌动作电位参数的影响

模拟心律失常(H2O2200 mmol·L-)灌流液灌流3 min后,(APA),(RMP),VMAX各项参数与正常对照组相比未见统计学意义,APD50和APD90与正常对照组相比时程明显增加(P＜0.001和 P＜0.001)。雷诺嗪(10 μ Μ)+H2O2灌流3 min 后 ,APD50和APD90与单纯灌流H2O2相比显著降低动作电位时程(P＜0.05和 P ＜0.01)。TTX(2 μ Μ)+H2O2灌流 3 min后,APD50和APD90与单纯灌流H2O2相比显著降低动作电位时程(P＜0.05和 P＜0.001),其(APA),(RMP),VMAX各项参数无明显变化。实验结果见表1和图1。

表1 雷诺秦对豚鼠心室肌动作电位的影响(±s,n=6)

表1 雷诺秦对豚鼠心室肌动作电位的影响(±s,n=6)

*P＜0.05,***P＜0.001 vs control;#P＜0.05,##P＜0.01,##P＜0.001 vs H2O2group.

RMP(mV) APA(mV)Vmax(V/S)APD50(mS)APD90(mS)Control -80.67±1.96 104.33±7.50 42.60±11.74 218.33±26.29 246.33±26.89 H2O2 -77.83±2.64 100.83±7.99 39.00±9.49 293.33±25.67*** 365.33±37.07***H2O2+RAN -78.83±1.33 97.17±7.96 36.33±9.24 253.17±34.01# 287.50±23.81##H2O2+TTX -78.50±1.38 96.00±7.87 28.66±8.21* 249.33±34.24# 280.83±20.12###

图1 雷诺嗪对晚钠电流的抑制作用

2.2 雷诺嗪对豚鼠心室肌收缩力的影响

按文献[5]的方法,将给药前豚鼠心室肌条的收缩幅度设定为 100%,分别灌流 H2O2200 10 μ Μ、雷诺嗪(10 μ Μ)+H2O2和 TTX(2 μ Μ)+H2O2灌流 3 min后,与正常组比较,H2O2组收缩力明显降低(80.66±6.53)%,P ＜0.05)。雷诺嗪(10 μ M)+H2O2和TTX(2 μ M)+H2O2组乳头肌的收缩幅度与对照组无显著统计学意义(93.00±6.63和93.67±6.12)%,(P＞0.05),见图2。

图2 雷诺嗪对心室肌收缩力的影响

3 讨论

心肌细胞膜上的Na+通道、Na+/Ca2+交换(包括反向Na+/Ca2+交换)装置和Na+/K+三磷酸腺甘(ATP)酶协同作用,负责Na+的正常转运并保证细胞内Na+内环境的稳定。正常情况下,Na+主要通过电压依从性Na+通道和Na+/Ca2+交换途径进入细胞内,而Na+向细胞外的转运则主要通过Na+/K+ATP酶和反向Na+/Ca2+交换机制完成。心肌细胞的除极是由快速Na+内流完成的,此电活动持续时间甚短,仅1-2 ms。0相除极完毕后,Na+通道迅速关闭并持续于整个复极期,直到下一次除极Na+通道才重0相新开放。但某些情况下,心肌细胞复极期的Na+通道并未完全失活而处于部分开放状态并形成内向离子流,即晚/Na[6]。晚近研究证明,心肌细胞内Ca2+超负载与复极期晚钠离子流(late sodium current,晚/Na)内流关系密切[7]。与除极期钠离子(Na+)内流相比,此Na+内流的发生较晚,故名晚/Na。由晚/Na介导的细胞内Ca2+超负载是引起心肌舒缩功能障碍,进而加重心肌缺血和发生心律失常的重要机制。晚/Na抑制剂雷诺嗪能有效抑制晚/Na内流,进而缓解心肌缺血,改善心脏舒缩功能和遏止相关心律失常的发生。

实验证实活性氧、过氧化氢等,引起Na+上升和细胞Ca2+超载,过氧化氢可导致晚钠增加,H2O2对心肌细胞膜电位的影响是早期的动作电位持续时间增加,导致细胞内钠钙交换交换增加,通过细胞外钙,使细胞钙超载。心肌细胞钙超载导致心肌电不稳定(即心律失常)和收缩功能障碍(即心功不全)。因此,阻断晚钠可能是关键,以减少H2O2诱导心律失常活动和收缩功能障碍,过氧化氢引起心肌细胞心律失常,主要由于晚钠的增加引起的APD和早期后除极,本实验证实采用雷诺嗪和河豚毒素干预H2O2诱导豚鼠心室肌细胞可降低该细胞动作电位的延长。

进一步研究发现,心肌处于缺血、缺氧状态下,尤其是直接暴露于超氧阴离子和溶血磷脂等缺氧代谢产物时,心肌细胞Na+通道便不能完全失活而形成晚/Na,造成细胞内Na+浓度过高,进而通过反向Na+/Ca2+交换途径致使细胞内Ca2+超负载[8],并由此通过下述几种病理生理机制参与缺血性心脏病及其相关疾病的发生和发展:(1)心肌细胞复极期Ca2+超负载引起心肌主动松弛功能障碍和舒张期室壁张力增高,临床上表现为心脏舒张功能不全并进而发展为心脏的收缩功能不全;(2)增高的室壁张力则挤压室壁内血管床,造成心肌的缺血,尤其是心内膜区域的缺血,临床上则表现为运动受限和心绞痛发作;(3)与晚/Na相关的心肌细胞动作电位时间延长和细胞间的复极不一致便成为临床上心律失常发生的电生理基础[9,10]。

晚/Na直接参与缺血性心脏病及其相关疾病的病理生理过程,是其发生发展的重要机制。这项研究的结果表明,雷诺嗪钠或河豚毒素减少过氧化氢诱导的心律失常活性和心肌细胞收缩功能障碍,雷诺嗪可能降低活性氧诱导的心功能不全。通过阻止晚钠,可降低过氧化氢对心肌功能(电和收缩)的有害影响。本实验证实盐酸雷诺嗪可降低H2O2引起的豚鼠乳头肌动作电位动时程的增加和增强心肌收缩力,作用和TTX结果相似。因此,晚/Na抑制剂以其全新的机制发挥其抗心肌缺血、改善心脏舒缩功能和抑制心律失常发生的作用有待于进一步研究而应用于临床。

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