大鼠坐骨神经移植术后BDNF在脊髓内表达的实验研究

徐明珠,王悦书,孙鸿斌,崔树森

(吉林大学中日联谊医院手外科,吉林长春130033)

BDNF是一种重要的神经营养因子,已有研究证实它对中枢神经系统的运动神经元的生长、发育、分化、维持和损伤修复具有重要作用[1]。周围神经损伤作为神经元损伤一部分,BDNF是否在移植修复过程中发挥作用是值得探讨的问题。作者通过建立大鼠的自体神经移植模型,观察脊髓前角细胞内BDNF的定位表达及其变化,以进一步解析BDNF在外周神经损伤修复中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

健康成年雄性Wister大鼠60只,体重250-300 g(吉林大学动物实验室),随机分为对照组(假手术组)及实验组(坐骨神经移植组),每组各30只。各组按手术后3天、1周、2周、4周、6周、8周分为6个时间点,每个时间点各5只。主要试剂:兔抗鼠BDNF抗体(Santa Cruz公司),SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(武汉博士德)。使用浓度及方法严格按照说明书配置

1.2 模型制备与取材

10%的水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉大鼠,右侧臀部术区常规脱毛消毒,取斜行切口,切开皮肤,分离臀肌显露坐骨神经。对照组仅暴露坐骨神经后闭合切口。实验组于梨状肌下缘及其以远15 mm处分别切断坐骨神经,在12倍手术显微镜下,两处断端用11-0无损伤线行外膜缝合,制成神经移植模型。术后大鼠常规分笼饲养。

取材:对不同时间点大鼠在腹腔麻醉下开胸暴露心脏,左心室插入导管,先用生理盐水100 ml冲洗,再用含4%多聚甲醛缓冲液(pH=7.3)液灌注固定,待右心耳流出澄清灌注液时停止灌注,取L4-L6节段脊髓置于上述固定液内固定18-24 h后,经脱水,石蜡包埋,制成厚度为5 μ m的连续横断切片备用。

1.3 免疫组化的方法

切片进行脱蜡、水化后置于PBS洗3次各5分钟;然后将过氧化物酶滴在每张切片上,室温静置10 min以灭活内源性酶。抗原修复:电炉或者水浴锅加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)至95℃左右,放入组织加热10 min。滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min。甩去多余液体。滴加兔抗鼠BDNF(1∶50Santa)50 μ l,室温静置4℃过夜 。之后需在37℃复温45 min。然后按照SP试剂核说明书使用。DAB显色5-10 min,在显微镜下掌握染色程度;PBS终止反应;最后脱水、透明、封片、镜检。

1.4 图像分析及统计学处理 所得切片经放大400倍,随机选4个视野,测定BDNF阳性反应细胞的平均灰度值,得到的数据应用SPSS11.0软件包进行单因素方差分析,并做组间均数 t检验,以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

400倍镜下观察L4-L6脊髓切片发现,正常对照组各时相大鼠腰段脊髓中前角运动神经元均有少量BDNF表达,胞浆为淡黄色,各时相无明显变化(图1-1);实验组中脊髓运动神经元BDNF阳性表达以胞浆为主,染色为棕黄色颗粒,其细胞边界清楚,着色均匀。在术后3天-1周(图1-2、1-3),BDNF表达就开始增高并持续到术后2周(图1-4),表达呈现强阳性达高峰,在术后4周(图1-5)表达有衰减,6周-8周(图1-6)逐渐衰减但仍高于正常对照组的表达。统计学分析表明术后2周、4周、6周、7周、8周,两组间数据差异有统计学意义(P＜0.05,表1)。

图1 脑源性神经营养因子(BDNF)在脊髓前角中的免疫组化表达(×40)

表1 不同时相脊髓中BDNF阳性细胞的灰度值(n=5,±s)

表1 不同时相脊髓中BDNF阳性细胞的灰度值(n=5,±s)

*P＜0.05:与对照组比较差异有统计学意义

3 d 1w 2w 4 w 6 w 8 w对照组 121.20±2.78 122.66±2.64 121.02±3.03 117.77±3.51 118.95±4.68 119.40±2.34实验组 124.18±2.75 126.83±4.30 165.23±4.37* 155.82±4.25* 132.75±1.40* 129.45±2.28*

3 讨论

自体神经移植是治疗神经缺损的有效方法,保证神经功能有效修复的关键之一就在于受损神经元是否成活、数量及其功能状态[2]。BDNF是广泛存在于中枢神经系统及外周组织中神经营养因子,具有明显促进周围神经再生的作用,并有保护受损神经细胞存活、防止神经元死亡的作用[3]。当坐骨神经损伤后,由于轴索和髓鞘损伤,以至经逆行轴浆运输至胞体的BDNF及其他营养物质明显减少,中枢神经系统中的运动神经元胞体功能状态也随之发生相应的改变。本实验建立了大鼠自体的长段神经移植模型,通过免疫组化的方法检测BDNF在相应脊髓节段前角运动神经元内表达及时相变化规律,验证了移植术后BDNF在神经元胞体内表达增强,神经元的功能状态得到提高。提示内源性BDNF持续表达对损伤的神经元有保护营养作用,对轴突再生修复有促进作用。

在本研究的对照组中,BDNF在胞体内有少量表达,表明BDNF对维持正常神经元生理功能有一定的作用。在实验组中,BDNF表达变化具有时间依赖性。神经移植术后1周,相应脊髓节段运动神经元内的表达就开始升高,提示在神经损伤的早期BDNF就开始发挥作用。术后2周时,BDNF表达达到峰值,说明该时间点为神经轴突生长的活跃期。之后BDNF表达持续在较高水平,6-8周后逐渐降低,但至8周时表达仍高于正常对照组,表明BDNF可持续作用于神经元,防止神经元的凋亡,以保证神经处于良好的再生状态中,但神经的再生效率却逐渐减低。有相关研究证实1cm的大鼠坐骨神经移植术在术后4周才出现BDNF的表达高峰[4],而本研究在两周后就出现高峰期,是否意味着长段移植可更早地激发神经元胞体的功能状态还有待进一步研究。

周围神经损伤的实质是一种细胞损伤[5],因此必然累及到相应的神经元胞体,而胞体的功能状态也必然影响神经的再生与修复,二者是相辅相成的。本研究仅通过BDNF的表达来揭示长段神经移植术后脊髓运动神经元功能状态,但同时也证实BDNF对损伤的神经元有保护作用,并可促进神经元损伤后的修复。因此如能在神经损伤后能够早期、持续、有效地维持神经元的功能状态,将对神经损伤修复具有重要意义。

[1]Sharma HS.Neuroprotective effects of neurotophins and melanocortins in spinal cord injury:An experimental study in the rat using pharmacological and morphological approaches[J].Ann N Y Acad Sci,2005,1053:407.

[2]傅 阳,陈 亮,顾玉东.周围神经损伤后神经元保护的研究进展[J].国外医学,2003,24(5):266.

[3]Marcolw,Kotulska K,Larysz-Bryszm,et al.Extracts obtained from predegenerated nerves improve functional recovery after sciatic nerve transection[J].Microsurgery,2005,25(6):486.

[4]张立新,贾 桦,李薇薇等.BDNF在脱细胞同种异体神经移植物修复神经缺损后不同组织中的表达[J].中国医科大学学报,2008,37(3):325.

[5]Natsume A,Mata M,Wolfe D,et al.Bcl-2 and GDNF delivered by HSV-mediated gene transfer after spinal root avuision provide a synergistic effect[J].Neurotrauma,2002,19(1):61.