苏木乙醇提取物对坐骨神经损伤小鼠血清髓鞘碱性蛋白含量及神经功能的影响

张 辉,曹 剑,刘 飙,尹维田

(吉林大学中日联谊医院手外科,吉林长春130033)

本文应用苏木乙醇提取物(SME)作用于坐骨神经损伤Balb/c小鼠,拟通过髓鞘碱性蛋白的测定和神经电生理功能评定,研究苏木乙醇提取物在促进周围神经再生方面的应用价值。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

健康雄性健康雄性Balb/c小鼠84只,体重18-22 g(吉林大学实验动物中心),随机分为苏木醇提物高中低剂量组及生理盐水对照组。各按术后3天、5天、1周、2周,4周、8周、12周分为 7个时间点,每个时间点12只。主要试剂:苏木乙醇提取物(SME)购自陕西昌岳植化技术公司,小鼠髓鞘碱性蛋白(MBP)酶联免疫分析试剂盒购自Rapidbio公司。

1.2 模型制备与给药

1%硫喷妥钠100 mg/kg腹腔麻醉小鼠,术区常规消毒,做右侧臀部斜行切口,钝性分离肌肉,暴露坐骨神经。在坐骨结节下0.5 cm处完全切断神经干,12倍手术显微镜下将断端对位后以11-0无损伤线吻合断端两针,逐层闭合创口。

给药方法和剂量:采取灌胃方法给药。参照临床应用苏木原药剂量,等效换算为小鼠灌胃用剂量[5],将此数值作为给药的中等剂量,并以等比数列量确定高低剂量组用量。最终各组给药量为,高剂量组16 g/kg/d,中剂量组8 g/kg/d,低剂量组4 g/kg/d,取相应剂量苏木乙醇提取物以生理盐水溶解后灌胃。对照组给予同等体积生理盐水。连续给药至处死。

1.3 ELISA法测定小鼠髓鞘碱性蛋白(MBP)

按时间点顺序,每组取小鼠3只,眼球取血约0.5 ml,于Ep管中常温静置2 h后4℃冰箱过夜,次日5 000 r/min离心3 min,取上层血清,储存于-20℃冰箱备用,待所有动物取材完毕后同时进行ELISA测定。方法严格遵照试剂盒说明书。

1.4 神经电生理检测

应用Medtronic Keypoint肌电/诱发电位仪,4、8、12周时实验动物双侧坐骨神经均作检测,主要观察动作电位波幅(AMP)和运动神经传导速度(MNCV)的变化。检测方法:1%硫喷妥钠腹腔麻醉动物后,无菌消毒术野,俯卧位暴露坐骨神经总干,同芯针电极刺入小鼠比目鱼肌肌腹内作为记录电极,接地电极置于鼠尾部,以平行刺激电极分别于吻合口近侧坐骨结节水平及远侧坐骨神经分支处给以超强刺激(电流10 mA),游标卡尺测量并输入刺激电极间距离,计算得出运动神经传导速度(MNCV)。室温控制在24摄氏度。运动神经传导速度=两刺激电极间距离/动作电位潜伏期差值(传导时间)。

1.5 统计学方法

应用SPSS13.0软件对各时间点数据进行组间 t检验,P＜0.05具有显著性差异。

2 结果

2.1 髓鞘碱性蛋白酶联免疫分析 标准曲线如图1。各时间点血清MBP浓度对比结果见表1,高中低剂量组分别与对照组行组间 t检验,P＜0.05时存在显著差异。

图1 MBP ELISA标准曲线拟合方程为Y=1/(19.050-10.753X0.06)

表1 各时间点动物MBP浓度对比结果

2.2 神经电生理检测 4、8、12周各时间点电生理检测结果见表2,高中低剂量组分别与对照组行组间t检验,P＜0.05时存在显著差异。

表2 4、8、12周各时间点电生理检测结果 P＜0.05存在显著性差异

3 讨论

关于周围神经损伤后局部免疫反应对神经再生的影响以及应用免疫抑制剂促进周围神经再生的机制已经有许多相关研究[7-9]。近年的重点则集中于免疫抑制剂FK506,1994年Gold[10]首先报道FK506能提高大鼠坐骨神经挤压伤后的轴突再生率之后,国内学者在2000年发现在异体手移植术后联合应用FK506的过程中,移植手的神经生长速度快于同平面自体断肢再植[11]。此后的一系列研究使FK506促进神经再生的作用得到了普遍的认可[12,13]。

然而FK506造价高昂的同时又不乏免疫抑制类药物的副作用。本文通过对苏木乙醇提取物的研究,已经确定了SME对坐骨神经损伤Balb/c小鼠的免疫功能存在显著的抑制作用,且存在明确的量效关系。本文进一步的研究结果证明,通过抑制损伤后的免疫反应,SME可以降低神经损伤局部的破坏程度,从而加速神经再生。本研究作为一个应用中药提取物抑制免疫反应促进神经再生的初探,在对之后研究提供实验基础的同时也面临着诸多问题,比如SME促进周围神经再生的分子生物学机制,对神经元内相关细胞因子表达的干预等,都需要更深入的研究。

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