大鼠脊髓半切损伤后外源性NEP1-40对神经中丝NF200表达的影响

边 涛，朱 涛，刘 通，李 鑫

(天津医科大学总医院，天津300052)

中枢神经系统内的微环境对受损神经轴突的存活和再生至关重要。激发神经元轴突自发生长的内在潜力并为新生的轴突提供良好的环境是促进伤后脊髓功能修复的有效途径［1］。Nogo-A蛋白是公认的中枢神经系统损伤后微环境内具有阻碍轴突再生作用的髓磷脂相关抑制物，其主要与相关受体(NgR)结合发挥作用。Nogo受体拮抗剂(NEP1-40)能够竞争性的与 Nogo-A蛋白受体结合，从而发挥有利于轴突再生的作用。目前关于NEP1-40的研究较少且对其作用效果评价不同。2008年11月～2009年7月，我们观察了大鼠脊髓半切损伤注射外源性NEP1-40后神经中丝蛋白NF200表达变化，探讨NEP1-40在脊髓损伤修复的中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 NEP1-40购自(北京博奥森生物技术有限公司);小鼠抗大鼠NF200抗体、适用于一抗为小鼠来源的SABC试剂盒、DAB试剂盒均购自武汉博士德公司。雌性Wistar大鼠60只(中国医学科学院放射所实验动物中心提供)，体质量200～220 g。

1.2 动物分组及脊髓半横断损伤模型的制备 将60只大鼠随机分为三组各20只。模型组和治疗组均予水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，备皮，固定，常规消毒皮肤。定位T8～10棘突，取背部正中切口，逐层分离组织，暴露椎板和棘突，咬除棘突，显微镊夹除T8椎板暴露T10脊髓。用持针器夹持自制显微刀片，从脊髓后正中沟右侧垂直刺入脊髓至腹侧面，沿水平方向切断右侧半脊髓，确保完全横断。自制注射管管口夹扁插入硬膜下，固定套管部分，用青霉素盐水冲洗伤口，小片自体筋膜覆盖骨窗，逐层缝合，管末端暴露于皮肤外约1 cm，导丝封闭外口。术后单笼单鼠饲养，密切观察食、水及大、小便情况，少数排尿功能恢复差者予膀胱区按压。每日辅助改变大鼠体位，预防泌尿系统感染和褥疮。术后第1天始模型组每天给予PBS 25 μl，连续7 d;治疗组予NEP1-40 15 μg 溶于 PBS 25 μl，连续7 d。假手术组仅去除椎板，不做脊髓半横断，术后不埋管，不用药;

1.3 行为学观察 根据关节活动，术后1、2、3、4周分别将大鼠置于平坦木板上(长、宽各约1 m)，由3名非本组实验人员独自观察后肢运动情况，每只4 min，同时行 Basso-Beattie-Bresnahan运动(BBB)评分法。后肢全瘫为0分，完全正常为21分。

1.4 神经中丝蛋白NF200检测 各组分别于术后1、2、3、4周水合氯醛腹腔注射麻醉，经左心室—主动脉插管，先予PBS(0.01M)200 ml 4℃灌注，再用4%多聚甲醛-PBS 200 ml灌注，然后取出损伤段及两侧各1 cm邻近脊髓组织，置于4%多聚甲醛-PBS固定液中过夜，脱水后行石蜡包埋，常规切片;免疫组化染色操作参考试剂盒说明，微波修复抗原，即用型一抗，DAB显色，以PBS代替一抗作为对照。光镜下观察，胞质内有棕黄色颗粒者为阳性。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，以空白背景调整灰度，100倍下选取灰质4个视野以0.5 mm×0.5 mm网格计数NF200阳性细胞数。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。计量数据以±s表示。采用One-way ANOVA的LSD检验。BBB评分与NF200阳性细胞数目采用Spearman相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学变化 模型组和治疗组术后均可见右后肢迟缓性瘫痪，鼠尾左偏，1 d后出现右后肢痉挛性瘫痪(因脊髓震荡、炎症反应、水肿等原因左后肢运动不同程度受累，5 d左右多可恢复)。术后1周内大鼠活动明显减少，有利于内置管的固定，同时饮水增加，饮食减少，少部分发生二便障碍。2周内少数大鼠出现左后肢咬伤咬残现象，为典型的脊髓半横断表现。假手术组未出现行为学变化，BBB评分为21分。模型组和治疗组各时间点BBB评分见表1。

表1 模型组和治疗组BBB运动功能评分(n=20，分，±s)

表1 模型组和治疗组BBB运动功能评分(n=20，分，±s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

分组 1周 2周 3周 4周1.50±0.50 4.30±0.67 6.70±1.20 9.70±0.83治疗组 2.40±0.65* 8.72±1.19△11.70±0.84△14.60±1.19模型组△

2.2 NF200阳性神经元数目 假手术组未见明显阳性染色细胞;模型组与治疗组在断端两侧灰质内NF200阳性神经元数比较见表2。

表2 模型组与NF200阳性神经元数目(n=20，个，±s)

表2 模型组与NF200阳性神经元数目(n=20，个，±s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

分组 1周 2周 3周 4周2.18±0.44 2.84±0.22 5.56±0.36 8.06±1.16治疗组 3.18±0.34* 5.02±1.11* 8.46±0.69△15.92±1.00模型组△

2.3 治疗组BBB评分与NF200阳性细胞数目的相关性 BBB评分有随NF200阳染神经细胞的数目增多而增加的趋势，两者呈正相关(r=0.937，P＜0.01)。

3 讨论

中枢神经系统有髓神经纤维由轴突和髓鞘组成，髓鞘是包裹在轴突外的管状阶段性结构，主要成分由类脂和蛋白质所组成，被称为髓磷脂(myelin)［2］。随着对脊髓损伤后微环境重要性认识的逐渐加深，髓磷脂相关抑制物Nogo蛋白成为近年来的研究热点。Nogo基因表达三种蛋白质产物，其中Nogo-A含1 163个氨基酸残基，为Nogo基因的全长表达产物，相对分子质量250 kD，是目前公认的神经轴突生长抑制因子，在成人的脑、脊髓、视网膜、背根神经节等部位均有表达。Nogo-A位于细胞外的66个氨基酸肽段Nogo-66是其发挥抑制作用的主要功能结构域，与位于神经元轴突的细胞膜表面的Nogo-66受体(NgR)结合，通过信号转导，诱发神经轴突生长锥溃退，从而抑制轴突再生［3，4］。

2002 年GrandPre等［5］通过对Nogo-66片段多种分解组合研究发现，发挥亲和受体NgR作用的片段可以和发挥抑制轴突生长作用的片段分开，并分离得到了 Nogo-66的40个氨基酸残基片段 NEP1-40。NEP1-40与NgR结合，但不激发抑制轴突生长的生物信号，被视为Nogo-A的特异竞争性受体拮抗剂。目前关于NEP1-40的研究报道很少。早期实验认为NEP1-40可以促进皮质脊髓束再生通过损伤区，并推测与受体NgR主要分布于这些纤维束有关［5］。以往的实验多以神经示踪方法，观察损伤后被标记的神经纤维束生长的状况;本实验通过观察神经中丝蛋白NF200的表达对NEP1-40能否促进轴突再生进行评价。再生过程中轴突无合成蛋白的能力，恢复中的神经元胞体不断合成新的蛋白质及其他产物输向轴突，所以目前的观点认为很多成熟的神经细胞在轴突损伤后并没有死亡，这些结构是神经再生的基础。神经中丝(NF)是神经元特有的结构蛋白，特异性的分布于神经元的胞体及突起内，在胞体内多交叉成网，主要构成神经胞体和神经轴突的细胞骨骼框架并起维持作用;此外在轴浆运输中，对微管起协调作用。NF根据相对分子质量的不同可分为NF68、NF160和NF200三种，其中NF200在正常情况下只存在于轴索中，而胞体不含或很少含有，故正常时NF200胞体染色为阴性。当脊髓损伤后，损伤区邻近神经元在创伤刺激及多种诱导因子的作用下，开始大量合成及积存NF200，以适应轴突再生的需要，NF200积存于胞体内而使胞体着色。故此NF200作为反应神经元功能，指示轴突再生状况的一个间接指标［6，7］。根据NF200在损伤前后变化的特性，本实验观察了受损脊髓节段神经元内NF200的变化，发现阳染的神经元在损伤区临近的喙侧和尾侧均有分布，可见脊髓损伤后损伤区两侧保留的神经元具有自发的轴突再生潜力;治疗组NF200阳染神经元数目明显多于对照组，说明脊髓创伤后外源性NEP1-40有利于轴突再生;治疗组运动功能相对恢复得更好，且BBB评分随NF200阳性神经元数量增加而增高，提示NEP1-40的作用机制为促进神经轴突再生。

综上所述，NEP1-40促进脊髓损伤后轴突再生效果确切;NEP1-40作为一种多肽类产物，具有便于合成与提取等优点，有一定的临床应用前景。

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