丙戊酸对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

邵翠杰，许洪升，陈忠平

(1徐州医学院麻醉学院，江苏徐州221002;2徐州市中心医院;3中山大学肿瘤防治中心)

目前胶质瘤化疗的临床有效率较低，除血脑屏障限制药物进入中枢神经系统外，肿瘤细胞对化疗药物耐药是重要原因［1］。丙戊酸(VPA)是胶质瘤术后预防癫痫的常用药物，我们前期研究发现，其在抗癫痫的同时能够增强化疗药物杀伤肿瘤的效果。2008年9～12月，我们将VPA分别与顺铂(DDP)和替莫唑胺(TMZ)联用，观察了其对胶质瘤细胞株化疗敏感性的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 10种胶质瘤细胞株T98-G、SF295、U87、UW28、UWR-7、SF767、U251、SKMG-1、SKMG-4、和MGR-2。RPMI-1640培养液(含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素)、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibcol公司)，MTT、DMSO、VPA溶液(Sigma公司)，细胞裂解液(Cell Signaling公司)，DDP(山东齐鲁制药厂)，TMZ(天津天士力公司)。超净工作台、CO2细胞培养箱(Shel Lab)、倒置显微镜(Olympus)、低温离心机(Eppendorf)、-80℃冰箱(日本SANYO公司)、酶标仪(Model 550 Bio-Rad)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞株培养 复苏冻存的胶质瘤细胞株加入适量 RPMI 1640培养液，放入37℃、5%CO2、90%湿度培养箱中，常规换液、传代，取对数生长期细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，接种于96孔板中，100 μl/孔，每孔(2 ～3)×103个细胞。将96 孔板放入37℃、5%CO2、90%湿度培养箱中培养。待细胞生长到贴壁70%～80%进行试验。

1.2.2 药物分组及处理 取培养的细胞株分为五组。空白对照组予普通培养液常规培养(含有相同浓度溶媒);DDP组及TMZ组均分别按其血药峰浓度的值设置 0.78、1.56、3.12、6.24、12.48、25、50、100 μg/ml 8个质量浓度;VPA联合DDP组予1.0 mmol/L VPA处理细胞72 h后加入上述浓度DDP;VPA联合TMZ组予1.0 mmol/L VPA处理细胞48 h后加入上述浓度的TMZ。

1.2.3 半数抑制浓度(IC50)及增敏倍数(ER)检测 五组每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，37℃作用4 h，吸去每孔上清，加入100 μl DMSO溶液，振荡5 min，自动酶标仪测定各孔570 nm波长处吸光度(OD)值。计算IC50及ER。ER=IC50(单药)/IC50(合用药物)，ER＞1表示非用增强。

1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件。计量数据以±s表示，各组间的差异采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

空白对照组IC50及ER均为0。VPA与DDP的协同作用见表1。VPA与TMZ的协同作用见表2。

表1 DDP组与VPA联合DDP组的IC50值与 ER 比较(±s)

表1 DDP组与VPA联合DDP组的IC50值与 ER 比较(±s)

注:与DDP组比较，*P＜0.05

细胞株DDP组 VPA联合DDP组 ER值IC50 T98-G 3.07±0.53 2.17±0.33 1.42 SF295 2.73±0.15 1.22±0.19* 2.24 U87 4.62±0.34 4.06±0.65 1.14 UWR-7 21.42±1.32 21.76±3.56 0.98 SKMG-1 7.54±0.58 3.09±0.78* 2.44 SKMG-4 9.59±0.98 9.68±1.89 0.99 MGR-2 2.97±0.42 2.89±0.37 1.02 U251 8.20±1.21 6.01±2.13 1.23 UW28 13.34±4.11 8.81±3.12* 1.51 SF767 5.32±3.12 2.09±1.23*2.55

表2 TMZ组与VPA联合TMZ组的IC50值与 ER 比较(±s)

表2 TMZ组与VPA联合TMZ组的IC50值与 ER 比较(±s)

注:与TMZ组比较，*P＜0.05

细胞株TMZ组 VPA联合TMZ组 ER值IC50 T98-G 9.41±3.42 9.82±2.58 0.96 SF295 8.23±2.23 8.08±1.98 1.02 U87 5.35±1.91 3.15±1.12* 1.70 UWR-7 11.92±2.32 3.25±0.56* 3.67 SKMG-1 6.83±1.58 5.69±1.78 1.21 SKMG-4 4.34±1.98 3.88±1.09 1.12 MGR-2 8.92±2.42 6.96±0.37 1.28 U251 1.45±0.29 1.09±0.09 1.33 UW28 4.91±1.11 1.48±3.12* 3.31 SF767 4.32±1.12 1.59±0.48*2.72

3 讨论

研究证实，组蛋白乙酰化修饰与肿瘤发生有关。组蛋白乙酰化和脱乙酰化参与了真核基因组整体表达水平的调控，是一可逆的动态过程，而其稳定状态的维持则是多种组蛋白乙酰基转移酶(HATs)和组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)共同作用的结果［2］。HDAC抑制剂主要通过改变组蛋白的乙酰化程度来改变染色质结构，从而调控基因表达。VPA作为HDAC抑制剂的一种，可能是通过改变肿瘤细胞组蛋白乙酰化状态来改变相关基因的转录水平，从而发挥抗肿瘤作用。

DDP是治疗胶质瘤的一线化疗药物之一，由于耐药性的存在，极大地影响了胶质瘤对其敏感的程度，限制了其临床疗效。胶质瘤对DDP的耐药机制复杂，是多因素综合作用的结果。细胞周期改变可能与DDP耐药有关［3］。DDP的细胞毒作用主要是与核蛋白连接，形成药物与DNA链外、内交联以及DNA-蛋白质交联，引起DNA损伤，使细胞阻滞于G0/G1期不能进入S期，导致细胞死亡［4］。我们前期研究结果提示，VPA作用于人胶质瘤细胞后，可使细胞周期发生变化，呈G1或G2/M期阻滞，提示VPA将细胞阻滞于DNA合成前期，阻止DNA合成。本研究发现，应用VPA处理胶质瘤细胞72 h后，再用DDP，则DDP杀伤力增强。提示VPA可能增强胶质瘤细胞对化疗药物DDP的敏感性。其机制可能是应用VPA之后，打破了乙酰化与脱乙酰化之间的平衡状态。组蛋白高度乙酰化使染色体结构疏松，能够激活多种转录因子，抑制DNA复制;而且处于松弛状态染色体，利于DDP进入细胞内部，与DNA结合发挥作用。但是在SKMG-1、U251、UW28、SF767 细胞，单独应用 VPA 未达到有效的抑制作用;联合应用后亦能促使DDP杀伤胶质瘤细胞的效果增强，此说明单独应用VPA能够改变染色体的结构状态，有利于DDP进入细胞结合更多的DNA，形成加合物杀伤细胞。部分胶质瘤细胞联合用药未出现预期的协同作用，是否与用药剂量、用药时间有关系尚不清楚。

TMZ是一种新型的口服二代烷化剂咪唑四嗪类衍生物，其通过对DNA的强甲基化，导致DNA错配修复失败而抑制肿瘤细胞生长［5］。而DNA甲基化影响人类基因组的转录抑制、染色质结构修饰、基因组印迹［6］，抑制重复序列及寄生DNA成分对基因组完整性的损害［7］。除了DNA甲基化，组蛋白的乙酰化修饰也能影响 DNA结构变化，影响基因表达［8］。VPA是HDAC抑制剂，进入人体后能促使组蛋白保持高度乙酰化，使染色体保持松弛状态，在这种情况下应用TMZ可使特定部位的DNA断裂不能进行修复，达到更有效的抗肿瘤作用。本研究结果证实，体外VPA在1.0 mmol/L的浓度时，能够增强DDP、TMZ这两种不同的化疗药物对大部分胶质瘤细胞的杀伤作用。证实VPA可增强DDP和TMZ的杀伤肿瘤作用，但其具体作用机制还有待于进一步研究。

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