脐血DC-CIK共培养体外抗肿瘤效应及趋化性的实验研究

李贵新，李鹏鑫，郭 璐，路 中，张金龙，张 敏

(潍坊医学院，山东潍坊261031)

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是将人外周血单个核细胞在体外应用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞［1］。CIK具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感等特点及优势。2008年12月～2010年1月，我们将CIK与树突状细胞(DC)共培养成DCCIK细胞，观察其对人白血病K562细胞、人淋巴瘤raji细胞、人乳腺癌MCF-7细胞杀伤活性的影响及CIK细胞的趋化性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 脐血由潍坊医学院附属医院产科提供(健康产妇分娩正常足月胎儿后于无菌条件下采集，经肝素钠抗凝)。人白血病K562细胞、人淋巴瘤raji细胞、人乳腺癌MCF-7细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。1640培养基(Gibco公司)，淋巴细胞分离液(天津TBD)，CD3单克隆抗体(北京博特纳)，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(上海碧云天)，γ-INF、IL-2、IL-4、IL-8、IL-1α、GM-CSF、TNF-α、PGE-2、MCP-1 等均购自上海普欣生物技术有限公司、CO2培养箱(日本三洋)，倒置显微镜(重庆奥特)，全自动酶标仪(深圳雷杜)，离心机(北京白洋)，流式细胞仪(美国BD公司)，趋化小室(江苏麒麟贝尔)。

1.2 CIK、DC的诱导、扩增和培养 无菌采集脐血，分别行CIK、DC诱导、扩增和培养。收获培养成熟的CIK、DC细胞计数后以DC∶CIK=1∶5的比例混合培养，培养液为含IL-2 500 IU/ml的CIK细胞培养液，共培养3 d。

1.3 细胞杀伤率的检测 以培养12 d的CIK、DCCIK作为效应细胞，K562、raji、MCF-7细胞作为靶细胞。取对数生长期K562、raji、MCF-7细胞，调整浓度为5×104/ml，CIK、DC-CIK的细胞浓度分别调整为2.5 ×105/ml、5 ×105/ml、1 ×106/ml，效靶比依次为为 5∶1、10∶1、20∶1。分为实验组、效应细胞组、靶细胞组，每组3个复孔，实验组每孔加效应细胞、靶细胞各100 μl，靶细胞组每孔加入靶细胞、1640培养液各100 μl;效应细胞组每孔加入效应细胞、1640养液各100 μl。置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。按MTT细胞增殖及细胞毒性试剂盒说明书，加入MTT试剂10 μl每孔37℃孵育4 h，再每孔加入formazan溶液100 μl，37 ℃孵育4 h，待充分溶解沉淀后于全自动酶标仪检测仪(波长570 nm)检测吸光度值(A值)，计算杀伤率。杀伤率=［1-(实验孔A值-效应孔A值)/靶细胞孔A值］×100%

1.4 CIK细胞趋化性检测 采用趋化实验。吸取培养第12天的DC-CIK细胞，设立阴性对照组、K562培养上清液组、IL-8组、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)组，于趋化小室的下室分别加入PBS、K562细胞培养上清液、rhIL-8、MCP-1。置细胞培养箱180 min后，显微镜下(200×)计数穿过滤膜的CIK细胞的穿膜细胞数。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。计量数据以±s表示，均数比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC-CIK和CIK的杀伤活性 见表1。

表1 CIK和DC-CIK对K562、raji、MCF-7细胞的杀伤作用比较(%，±s)

表1 CIK和DC-CIK对K562、raji、MCF-7细胞的杀伤作用比较(%，±s)

注:与相应效靶比的CIK细胞比较，*P＜0.01;与同一细胞效靶比5∶1比较，△P ＜0.05;与同一细胞效靶比10∶1比较，▲P ＜0.05

效应细胞 K562细胞 raji细胞 MCF-7细胞CIK效靶比5∶1 20.94±1.99 19.60±2.39 16.09±1.88效靶比10∶1 37.49±2.99△ 33.73±2.64△ 27.98±1.84△效靶比20∶1 54.06±3.73▲ 52.17±2.53▲ 51.05±1.87▲DC-CIK效靶比5∶1 31.76±3.03* 28.52±1.96* 21.63±2.95*效靶比10∶1 46.03±2.57＊△ 41.20±2.80＊△ 33.73±2.06＊△效靶比20∶1 63.25±2.54＊▲ 62.29±3.18＊▲ 59.08±3.11＊▲

2.2 CIK细胞的趋化性 对照组穿膜细胞数为(16.89±2.02)个，K562组为(17.60±2.27)个，IL-8组为(25.35±6.13)个，MCP-1组为(28.47±4.37)个。K562组与对照组比较无统计学意义，IL-8组与对照组比较P=0.000 6，MCP-1组与对照组比较P=0.000 0。

3 讨论

多项研究表明，CIK细胞与DC共培养不仅能提高CIK细胞的杀伤作用，而且也能显著提高DC的功能，DC-CIK的主要优势为:①增殖活性高。DC与CIK细胞共培养后产生的细胞比同源CIK细胞具有更强的增殖活性，经抗原刺激后的DC-CIK细胞增殖数目进一步提高，可获得更多的效应细胞［2］。②细胞毒活性强。DC与CIK细胞共培养可增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。③细胞因子释放量大。细胞IL-12的分泌量比CIK细胞和DC单独培养时明显增加［3］。DC能使CIK细胞分泌IFN-7的时间延长，分泌量增加［4］。④表面标志表达量高。DC表面的 HLA-I和 HLA-Ⅱ分子及 CD40、CD50、CD56分子的表达增加;CIK细胞的增殖及表面的 CD3、CD4、CD28、CD40分子表达增加［5］。⑤抑制性T细胞数量、IL-10分泌量减少。CIK细胞中具抑制抗肿瘤免疫效应的细胞减少，共培养物上清中具有免疫抑制作用的 IL-10 减少［6］。

CIK细胞来源于T细胞亚群。本研究发现，IL-8、MCP-1作用后CIK穿膜细胞数明显升高，而K562作用后穿膜细胞数无明显增高，证实IL-8、MCP-1对CIK细胞具有趋化性，而K562细胞培养上清液对CIK细胞无趋化性。

综上所述，DC-CIK共培养可明显提高CIK细胞毒作用;CIK细胞存在趋化性。本研究为临床肿瘤的治疗提供了新思路。

［1］Schmidt-Wolf IG，Negrin RS，Kiem HP.et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity［J］.Exp Med，1991，174(1):139-149.

［2］Angela M，Tim G，Carsten Z，et al.Generation ofactivated andanti-Gen-specific T cell swith cytotoxic activity after coculture with dendritic cells［J］.Cancer Immunol，2001，9(18):251-255.

［3］Marten A，Renoth S.Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells a gainst multiple myeloma cells after coculture with idiotype-pulsed dendritic cells［J］.Haematologlca，2001，86(2):1029-1037.

［4］Fujii S，Shimizu K，Kronenberg M，et al.Prolonged IFN-gammaproducing NKT response induced with alpha-galactosylceramideloaded DCs［J］.Natl Immunol，2002，3(8):867-874.

［5］Ziske C，Marten A，Schottker B，et al.Resistance of pancreatic carcinoma celsis reversed by coculturing NK-like T cells pulsed with tumor derived RNA and CA19-9［J］.Molecular Therapy，2001，3(4):54-60.

［6］Schmidt J，Eisold S，Buchler MW，et al.Dendritic cells reduce number and function of CD4+CD25+cells in cytokine-induced killer cells derived from patients with pancreati carcinoma［J］.Cancer Immunol Immunother，2004，53(9):1018-1026.