外源性IL-18基因转染联合顺铂对胶质瘤C6细胞凋亡的诱导作用

蒋常文，夏春波，李鸿文，陈森洲，闫蕴力，周 思，刘 瑛，兰羚元

(桂林医学院人体解剖教研室，广西桂林541004)

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，目前其治疗仍是世界公认的难题。近年来研究表明，IL-18能诱导T细胞及NK细胞产生干扰素(IFN)-γ，从而抑制肿瘤细胞生长。有研究报道，将IL-18直接进行肿瘤内注射可抑制胶质瘤的生长，将IL-18基因修饰的肿瘤细胞疫苗接种至裸鼠皮下或直接注射至瘤体内可使致瘤性明显降低［1］。IL-18处理的树突状细胞可抑制胶质瘤C6细胞的生长，提高荷瘤鼠存活率［2］。最近，我们将IL-18基因导入胶质瘤C6细胞，建立了C6/IL-18细胞，通过外源性IL-18基因转染联合顺铂，观察对胶质瘤C6细胞的凋亡诱导作用。

1 材料与方法

1.1 材料 IL-18基因、pLXSN逆转录病毒以及亲代胶质瘤C6细胞保存于河北医科大学细胞研究室。顺铂购自齐鲁制药有限公司。MTT(噻唑蓝)、二甲基亚砜购自Sigma公司，吖啶橙(AO)和溴化乙锭(EB)购自华美生物试剂公司。

1.2 实验方法

1.2.1 C6/IL-18细胞的建立 应用Lipofection将LXSN/IL-18转染到ψ2细胞中，经G418细胞(400 mg/L)筛选后，收集G418抗性细胞克隆的培养上清(内含逆转录病毒)。在8 mg/ml聚凝胺(polybrene)存在下，将含逆转录病毒的培养上清与PA317细胞共同培养进行再次病毒包装。收集具有G418抗性、高表达IL-18 mRNA的细胞克隆培养上清，获得重组逆转录病毒，用于感染C6细胞。取增殖期的C6细胞，加入含8 mg/ml polybrene的病毒培养上清2 ml，6 h后加入新鲜培养液4 ml。24 h后加入G418(400 mg/L)筛选阳性克隆，获得重组逆转录病毒感染C6细胞。

1.2.2 细胞培养及药物配制 C6/IL-18、C6/pLXSN及C6细胞均以RPMI1640培养基培养，内含10%胎牛血清、青霉素 100 U/ml、链霉素 100 μg/ml。置37℃、5%CO2培养箱培养。用生理盐水将顺铂溶解、稀释，使其终质量浓度分别为0.3、3、30、60、120 μg/ml。

1.2.3 顺铂干预及细胞抑制率检测 分别取对数生长期的 C6/IL-18、C6/pLXSN和 C6细胞，经0.04%EDTA消化后，加入培养液吹打混匀，以1.5×105/ml接种于96孔培养板，每孔加入200 μl细胞悬液。24 h 后分别加入 120、60、30、3、0.3 μg/ml的顺铂，每组均做3个复孔;设不加药物为对照组。药物与细胞共同培养48 h，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，继续孵育4 h后，离心，吸去上清，每孔加入150 μl DMSO终止反应，振荡仪振荡10 min。用酶标仪在490 nm波长处测吸光度值(A值)。细胞抑制率=(对照孔A值-用药孔A值)/对照孔A值×100%。本实验重复3次，取平均值。

1.2.4 顺铂干预及细胞凋亡率检测 分别取对数生长期C6/IL-18、C6/pLXSN和C6细胞，经0.04%EDTA消化后，加入培养液吹打混匀，以5×104/ml细胞浓度接种于培养瓶中，培养24 h后加入终浓度为10倍血浆峰浓度(30 μg/ml)的顺铂。药物作用24 h后，去除培养液，0.04%EDTA消化细胞，倒掉消化液，用0.1 mol/L PBS悬浮细胞，800 r/min离心6 min，加入含AO和EB(均为0.05 mg/ml)的荧光染液，吹打混匀，将细胞滴至载玻片上，荧光显微镜下观察照相。镜下随机计数10个视野的细胞数，取平均值。凋亡率 =凋亡细胞数/总细胞数 ×100%。实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件。计量数据以±s表示，行单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞抑制率 见表1。

表1 三种细胞抑制率比较(%，±s)

表1 三种细胞抑制率比较(%，±s)

注:与C6/pLXSN和亲代C6细胞比较，*P＜0.05

顺铂质量浓度(μg/ml)亲代C6细胞C6/IL-18细胞C6/pLXSN细胞120 75.92±5.56*61.46±5.34 59.54±3.08 60 65.58±3.08* 54.13±6.52 53.92±5.18 30 58.05±5.34* 47.16±6.08 46.37±5.34 3 29.66±7.40* 21.30±5.19 20.96±4.81 0.3 5.92±1.35 6.46±2.11 5.86±1.58

2.2 细胞凋亡率 C6/IL-18细胞、C6/pLXSN细胞和C6细胞的凋亡率分别为24.12% ±3.13%、12.07% ±1.87%、11.52% ±1.93%。C6/IL-18细胞的凋亡率明显高于C6/pLXSN和C6细胞(P均＜0.05)，C6/pLXSN和C6细胞凋亡率比较无显著性差异。

3 讨论

脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，呈浸润性生长，与周围脑组织边界不清，具有治疗困难、生存期短、病死率高的特点，患者平均生存期为6～10个月，1 a生存率仅为30%，5 a生存率低于5.5%［3，4］。顺铂属于金属类化合物，能与细胞内生物大分子的亲核基团结合，引起DNA损伤，诱导细胞凋亡。近年来，随着采用高渗性开放血脑屏障、选择性颈内动脉灌注、间质化疗及鞘内注射等方法的应用，使得顺铂可通过血脑屏障，在胶质瘤的治疗中取得较好效果［5，6］。研究显示，将铂类抗肿瘤药单独应用或与亚硝基脲类、足叶乙甙、替莫唑胺联合已显示出良好的抗脑肿瘤效果［7］;有学者认为将顺铂与肿瘤坏死因子联合应用可增加对恶性胶质瘤细胞凋亡的杀伤作用［8］。

鉴于IL-18基因对肿瘤细胞有明显的抑制作用，最近有研究者将IL-18与异磷酰胺联合应用，发现可增加对骨肉瘤荷瘤鼠肺转移的抑制效果［9］。认为IL-18增加肿瘤对化疗敏感性的机制与IL-18能够诱导肿瘤细胞 fasL表达，导致细胞凋亡有关［10］。Chandrasekar等［11］研究表明，IL-18 在体外可诱导心血管内皮细胞凋亡，其机制与IL-18促进抑癌基因的表达、激活Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡抑制基因表达有关。但关于IL-18基因与顺铂结合是否能够增加对胶质瘤杀伤作用，目前尚缺乏研究。

综上所述，我们在以往研究的基础上将IL-18基因与顺铂结合探讨对胶质瘤细胞的杀伤作用，结果表明IL-18基因与顺铂结合可明显增加对胶质瘤细胞的抑制作用。该结果对于增加化疗药物的敏感性，减低药物的毒副作用，提高胶质瘤的治疗效果有一定的参考意义。

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