酮通颗粒质量标准研究

2010-05-22余晓东武夏明刘田云赵广成刘逢芹山东大学附属千佛山医院济南市5004山东大学药学院济南市500

中国药房 2010年11期

余晓东，武夏明，刘田云，赵广成，刘逢芹（.山东大学附属千佛山医院，济南市 5004；.山东大学药学院，济南市 500）

随着社会人群老龄化趋势的发展，缺血性脑病（中风）发病率呈上升趋势[1，2]。酮通颗粒原处方是本院临床协定方，在临床上应用多年，疗效确切。笔者在此方剂基础上研制开发的制剂酮通颗粒具有活血通络、祛瘀通脉的作用。为更好地控制该制剂质量，笔者对其进行了质量标准研究。

1 仪器与试药

Mettler AE-241型电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；515型高效液相色谱（HPLC）仪（美国Waters公司）；Model 500 labAlliance检测器（美国SSI公司）；ANASTAR数据处理系统（美国SUNTEK公司）；KQ-100D型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅有限公司）；HHS-118型恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）。

槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为 100081-200406、110861-200606、110860-200407）；银杏叶、三七、葛根对照药材（中国药品生物制品检定所，批号分别为 110866-200803、120941-200807、121178-200302）；酮通颗粒由本院制剂室制备（规格：双铝箔复合袋包装，每袋5 g，批号：080311）；甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20070110）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司，批号：1222YS）；硅胶G、硅胶H（青岛海洋化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 三七的TLC鉴别精密称取样品3 g，加入数滴水浸润、搅匀，加以水饱和的正丁醇30 mL，超声30 min，放置2 h，离心，取上清液，加30 mL的正丁醇饱和水，摇匀，放置使分层，取正丁醇层，蒸干，残渣加水溶解后用乙醚萃取2次（每次20 mL），弃去乙醚液，水层溶液蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，作为供试品溶液；取三七对照药材0.5 g，加入70%乙醇15 mL，超声30 min，过滤，滤液蒸去乙醇后加水溶解，用乙醚萃取2次（每次20 mL），弃去乙醚液，水层用正丁醇萃取2次（每次20 mL），取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，作为对照药材溶液；按酮通颗粒制备工艺制得缺三七药材的阴性样品，同法制得阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各3µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，上行展开10 cm，取出，晾干，喷以10%H2SO4-乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，置365 nm紫外光灯下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。三七的TLC见图1。

2.1.2 银杏叶的TLC鉴别[3]精密称取样品2 g，加甲醇20 mL，加热回流10 min，放冷，滤过，滤液蒸干，加水20 mL溶解，氯仿萃取2次（每次20 mL），水层蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，作为供试品溶液；取银杏叶对照药材0.5 g，加甲醇10 mL，加热回流，放冷滤过，溶液蒸干，加水10 mL溶解，氯仿萃取2次（每次10 mL），水层蒸干，残渣加甲醇溶解制得对照药材溶液；取槲皮素对照品，加甲醇制成每1 mL含0.03 mg的溶液，作为对照品溶液；按酮通颗粒制备工艺制得缺银杏叶药材的阴性样品，同法制备阴性对照溶液。吸取上述4种溶液各6µL，分别点于同一含4%醋酸钠的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水（5∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙酸溶液，热风吹干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。银杏叶的TLC见图2。

2.1.3 葛根的TLC鉴别称取样品3 g，加甲醇30 mL，超声30 min，放置2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液；取葛根对照药材0.5 g，加甲醇15 mL，超声30 min，放置2 h，取上清液蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为对照药材溶液；按处方比例制备缺葛根的阴性样品，同法制得阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。葛根的TLC见图3。

图1 三七的TLC1.供试品；2.阴性对照；3.三七对照药材Fig 1 TLC of P.notoginseng1.test sample；2.negative control；3.Radix Notoginseng

图2 银杏叶的TLC1.阴性对照；2.槲皮素对照品；3.银杏叶对照药材；4.供试品Fig 2 TLC of G.biloba1.negative control；2.quercetin control；3.Folium Ginkgo；4.test sample

图3 葛根的TLC1.阴性对照；2.葛根对照药材；3.供试品Fig 3 TLC of P.lobata1.negative control；2.Radix Puerariae；3.test sample

2.2 定量分析

2.2.1 溶液的制备[4，5]取样品2 g，精密称定（约相当于银杏叶药材1 g），加甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）25 mL，置水浴中加热回流30 min，冷却至室温，转移至50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；按酮通颗粒制备工艺制得缺三七药材的阴性样品，同法制得阴性对照溶液；再分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品2.62 mg、山柰素对照品2.28 mg、异鼠李素对照品1.24 mg，置于同一25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，制得混合对照品溶液。

2.2.2 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Diamond C18（250 mm×4.5 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%H3PO4（55∶45）；流速：1 mL·min-1；检测波长：360 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；柱压＜1200 Pa。理论塔板数按槲皮素峰计算应不低于2500。色谱见图4。

2.2.3 线性关系考察按上述色谱条件，精密吸取上述混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，注入液相色谱仪，测得峰面积。以槲皮素、山柰素、异鼠李素浓度（C）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，制备标准曲线，并分别进行线性回归，得回归方程，见表1。

图4 高效液相色谱图A.混合对照品；B.阴性对照；C.供试品；1.槲皮素；2.山柰素；3.异鼠李素Fig 4 HPLC chromatogramsA.mixture control；B.negative control；C.test sample；1.meletin；2.kaempferide；3.isorhamnetin

表1 总黄酮醇苷的回归方程及线性范围Tab 1 Regression equation and linear range of total flavonol glyconsides

2.2.4 精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液20µL，连续进样6次，记录峰面积。结果，峰面积的RSD分别为槲皮素1.21%、山柰素0.83%、异鼠李素1.63%。

2.2.5 稳定性试验精密吸取同一混合对照品溶液和供试品溶液各20µL，每间隔2 h进一针，连续考察8 h。结果，对照品峰面积的RSD分别为槲皮素0.31%、山柰素0.72%、异鼠李素0.59%，供试品峰面积的RSD分别为槲皮素1.68%、山柰素1.74%、异鼠李素1.92%。

2.2.6 重复性试验取同一批样品，精密称取5份，按样品测定项下的方法测定。结果，槲皮素、山柰素、异鼠李素的RSD分别为2.88%、4.61%、1.80%。

2.2.7 加样回收率试验取已知含量的同一批样品适量，共5份，精密称定，分别精密加入槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品溶液各1 mL，按“2.2.1”项下方法制成供试品溶液，照样品测定项下的方法测定。结果，平均回收率分别为96.21%、99.14%和95.00%，RSD分别为2.06%、1.19%、1.31%。

2.2.8 样品含量测定称取3份酮通颗粒，每份各2 g，精密称定，按“2.2.1”项下方法制得供试品溶液。吸取同批号供试品溶液和槲皮素浓度为62.88 μg·mL-1、山柰素浓度为54.72 μg·mL-1、异鼠李素浓度为29.76 μg·mL-1的对照品溶液各20 μL，依照“2.2.2”项下方法测定，记录各峰面积，以外标法计算总黄酮醇苷含量（总黄酮醇苷含量＝（槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量）×2.51），结果见表2。