VEGF 、VEGFR2在青春期大鼠睾丸、附睾及附睾精子上的表达

马 莉 田 宏 张 洁 艾庆燕 苗乃周 王海旭 王丽蓉 邱曙东＊ 张秋养＊

(1西安交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系,陕西西安710061;2延安大学医学院组织胚胎学教研室,陕西延安716000)

睾丸内精子发生和附睾内精子成熟是一个高度程序化和组织化的过程,一方面受到生精细胞自身因素的作用,另一方面还受到睾丸和附睾微环境的影响[1],此外还受到一些生物因子的作用。研究表明,在睾丸支持细胞和间质细胞、附睾输出小管上皮、前列腺、精囊及精液等都有血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的表达[2–4],推测VEGF和VEGFR2可能与雄性生殖生理相关,但它们在雄性生殖系统中的作用和机理尚不完全清楚。本研究采用免疫组化、免疫荧光技术在蛋白水平上研究VEGF和VEGFR2在青春期大鼠睾丸、附睾及附睾精子上的表达定位情况,旨在探讨它们在睾丸精子发生和附睾精子成熟中的重要作用,为进一步明确它们在雄性生殖过程中的功能提供理论依据和实验资料。

材料和方法

1.主 要试剂与动物组织标本的采集与处理

兔抗鼠多克隆VEGF、VEGFR2抗体购于美国Labvision公司,FITC标记的山羊抗兔 IgG、SP-9001试剂盒和DAB显色试剂盒均购于北京中山金桥生物技术有限公司。选择7-8周龄、体质量150-180 g的青春期健康雄性SD大鼠20只,购于西安交通大学医学院实验动物中心。

将出生后第8周大鼠200 g/L乌拉坦5 ml/kg腹腔麻醉,分别取睾丸和附睾组织,用于免疫组化的睾丸、附睾组织迅速入Bouin’s液固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片 5μm。用于免疫荧光的附睾组织,分离周围脂肪后剪碎,置于500μl 0.01 mol/L (p H7.0-7.4)PBS中沉淀,待沉淀后吸取上清液 (含精子)2200g离心15 min,可重复两次;4%多聚甲醛吹打固定30 min之后同上离心,用含50 mmol/L甘氨酸的PBS洗涤,2200g离心15 min后沉淀以0.01 mol/LPBS调整精子密度至30-40×109/L。将此精子悬液涂在铬矾明胶处理过的载玻片上,风干用于免疫荧光染色。

2免 疫组织化学染色 (SP法)

采用SP法进行免疫组化染色:组织石蜡切片脱腊至水后,在0.01 mol/L (p H6.0)枸橼酸缓冲液中微波修复抗原15 min后冷却至室温,30 ml/L双氧水孵育15 min消除内源性过氧化物酶,10 ml/L TritonX-100浸泡15 min以增加组织的可穿透性,50 ml/L正常羊血清37℃封闭25 min,滴加一抗 (1:100),4℃过夜。恢复室温40min,滴加生物素化二抗,37℃孵育1 h,室温放置40 min,加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素37℃孵育25 min,DAB显色3-5 min,苏木精复染1-3 min,常规脱水、透明、封片。以上各步骤间均用0.01 mol/L p H (7.0-7.4)PBS洗2次,每次5 min。实验以0.01 mol/Lp H(7.0-7.4)PBS液代替一抗作为阴性对照。以胞质或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性,并在Olympus BX51显微镜下拍照。

3免 疫荧光染色

附睾精子涂片在0.01 mol/L (p H6.0)枸橼酸缓冲液中微波修复抗原15 min,冷却至室温,30 ml/L H2O2封闭内源性过氧化物酶,10 ml/L TritonX-100中浸泡30 min以增加细胞的可穿透性,30 ml/L正常山羊血清室温封闭30 min后加一抗 (1:50),4℃孵育2夜。恢复室温40 min后滴加FITC标记的山羊抗兔 IgG(1:100),37℃孵育1 h,用甘油—碳酸氢钠湿封剂封片,以上各步骤间均用0.01 mol/L p H(7.0-7.4)PBS洗3次,每次 5 min。实验以 0.01 mol/Lp H (7.0-7.4)PBS代替一抗作为阴性对照。以出现较强黄绿色荧光为阳性,并用Olympus BX51荧光显微镜拍照。

结 果

1.V EGF和VEGFR2在睾丸中的表达

VEGF与VEGFR2免疫组织化学阳性反应呈棕黄色,在正常大鼠睾丸中均有表达。在睾丸中VEGF阳性染色主要位于精原细胞胞质、精子细胞发育中的的顶体、Sertoli细胞胞质以及精子残余体内,且间质中Leydig细胞胞质也有阳性表达(图Ⅰ-1);其中以发育中的顶体及精子残余体的阳性表达最强。VEGFR2阳性染色主要定位于精子细胞发育中的顶体内 (图Ⅰ-2),Sertoli细胞胞质弱阳性,间质中Leydig细胞胞质和部分血管内皮及管壁平滑肌亦呈阳性染色;精子细胞的胞质、初级精母细胞、次级精母细胞均为阴性。

2.V EGF和VEGFR2在附睾中的表达

在附睾中,VEGF蛋白几乎表达于附睾管上皮所有主细胞胞质中,呈粗大的阳性颗粒,近管腔游离面的纤毛也呈现阳性染色,亮细胞、晕细胞及基细胞未见阳性染色。VEGF在附睾体部表达最强,头部次之,尾部和始段表达较弱。该蛋白在附睾上皮中的表达呈现细胞特异性和区段特异性 (图Ⅰ-3～6)。VEGFR2阳性染色主要定位于附睾管上皮主细胞胞质,部分间质小血管内皮和毛细血管内皮也呈阳性染色,而亮细胞、基细胞及晕细胞均为阴性。该蛋白在附睾尾部表达最强、头部和起始段次之,体部未见阳性表达 (图Ⅰ-7-10)。

3.附 睾精子免疫荧光染色

以精子出现黄绿色荧光为阳性表达。VEGF与VEGFR2均可与精子头部顶体、尾部颈段、中段和主段相结合,呈较强的黄绿色荧光,而末段与精子核未见阳性荧光染色 (图Ⅰ-11,12)。

讨 论

血管内皮生长因子 (VEGF)是内皮细胞特异性强效有丝分裂原,也是公认作用最强的血管通透因子,VEGFR2是血管形成和血管生成的主要调节者;它们不仅在内皮细胞上有表达,在非内皮细胞上也有表达。国外有学者[2–4]报道 VEGF及其受体VEGFR2在人的睾丸、附睾、精囊和前列腺组织中均有表达,提示其可能与雄性生殖有关。但是,VEGF与VEGFR2是通过作用于睾丸和附睾的血管系统还是直接作用于生殖细胞而影响精子的发生和成熟仍不是很清楚。

研究以健康的青春期大鼠为对象,用免疫组化和免疫荧光在蛋白水平上较全面的检测了VEGF及VEGFR2在睾丸、附睾和附睾内精子上的表达,结果显示VEGF在大鼠睾丸生精上皮内有表达,其中以精原细胞胞质、精子细胞发育中的顶体、精子残余体和支持细胞胞质表达较强。VEGF在精原细胞的表达提示VEGF可能参与精原细胞有丝分裂的增殖分化过程,促进了精子的发生。已有研究表明,许多基因参与了顶体的形成,本研究发现VEGF的表达伴随精子细胞顶体发育的全过程,这提示在顶体形成过程中VEGF也发挥了重要作用,提示可将其作为顶体发育的重要标志之一;其在精子残余体上的较强表达表明VEGF可能参与精子变态过程,调节其中某些相关基因的表达;生精细胞的分化增殖必须在适宜的微环境中完成,VEGF在Sertoli细胞和Leydig细胞上的表达说明,VEGF在这些细胞的分泌可能参与了自身的分泌活动和睾丸微环境的调节。在体内VEGF只有通过与其受体相结合才能发挥生物学效应,而VEGFR2是其最主要的受体之一。研究证明了VEGFR2不仅在睾丸生精上皮精子细胞发育中的顶体、精子残余体中有较强表达,在 Sertoli细胞和Leydig细胞胞质也有表达,这些表达特点提示VEGF可能通过与VEGFR2相结合,调节生精细胞的分泌活动,为生精细胞的增殖和分化创造条件;而 VEGF与VEGFR2在 Sertoli细胞和Leydig细胞上的同时表达说明,它们可能通过直接与自身受体的结合促进间质细胞合成和分泌睾酮,参与睾丸微循环的构建,维持并促进精子的发生。本结果与 Collin[5]等在人睾丸 Sertoli细胞和Leydig细胞内的研究基本一致,而与Angele等[6]在小鼠睾丸生殖细胞上的研究不完全一致,可能与种属差异、机体的健康状态有关。此外,有研究表明[7–9],VEGF在睾丸中的表达也与睾丸血管发生、新生血管形成有密切关系,提示VEGF还可能以旁分泌形式作用于间质血管的VEGFR2蛋白,调节毛细血管的通透性。

研究还显示VEGF及其受体VEGFR2在附睾管上皮主细胞中也有表达,VEGF在附睾体部表达最强,头部次之,尾部和始段表达较弱,其表达具有细胞特异性和区域特异性;而VEGFR2的表达也呈现细胞特异性和区域特异性,但从附睾起始段到尾段,其阳性染色以尾部最强,头部次之,起始段最弱而体部阴性。本结果与Johnston等[10–11]在小鼠附睾中的研究结果基本相同。以上表达特点提示附睾上皮主细胞分泌大量的VEGF蛋白可能通过与自身胞质内的的VEGFR2作用,调节其自身的吸收和分泌功能,进而影响附睾管腔液的组成及精子成熟的微环境,参与精子的睾丸后成熟。在附睾中附睾功能的发挥具有明显的区段特异性,多种与精子成熟有关的蛋白质和多肽在附睾的不同区段被分泌,VEGF及VEGFR2在附睾中表达的区段特异性说明两蛋白不仅参与构建精子附睾内成熟的微环境,共同调节附睾微循环的生理功能,而且各自可能作为特殊物质在精子的附睾成熟过程中发挥不同的作用。

Obermair等[12]首次用免疫荧光法在人类的精子表面定位了VEGF及VEGFR2。本研究免疫荧光法检测了VEGF及VEGFR2在大鼠附睾精子上的定位,他们在精子表面不同区段表达的特点表明,精子在循附睾头、体、尾移行过程中发生的各种变化可能与VEGF和VEGFR2相关,他们可能通过与周围微环境之间的相互作用,改变精子的表面结构,在精子受精能力和运动能力的获得中发挥重要作用。

研究VEGF和VEGFR2在大鼠睾丸、附睾及附睾精子上的表达定位和特点,提示它们可能以自分泌或旁分泌的形式共同调节睾丸和附睾的微环境,并可直接或间接的影响精子的发生、发育和成熟,特别是精子顶体的形成过程,但要完全阐明它们在雄性生殖中的作用及其相关机制仍需作进一步的研究。

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图 版 说 明

VEGF和VEGFR2在青春期大鼠睾丸、附睾及附睾精子上的免疫组化和免疫荧光表达

图1-10:DAB染色,苏木精复染;图11、12:荧光染色。标尺=50μm

1:VEGF在睾丸中的表达,VEGF在精原细胞、精子细胞、Sertoli和Leydig细胞胞质阳性;2:VEGFR2在睾丸中的表达,VEGFR2表达于精子细胞发育中的顶体和Leydig细胞。黑、红色箭头分别示Leydig细胞、精子细胞发育中的顶体。3～6:VEGF在附睾中的表达,主细胞胞质强阳性;分别为附睾的头、体、尾和尾部,体部表达最强。7～10:VEGFR2在附睾中的表达,主细胞核上区阳性;分别为附睾的头、体、尾和头部,体部阴性。黑色、绿色和红色箭头分别示附睾上皮亮细胞、基细胞和晕细胞,在三种细胞中VEGF和 VEGFR2均表达阴性。11、12:VEGF和VEGFR2在精子上的表达,VEGF和 VEGFR2均定位于精子头部的顶体,尾部的颈段、中段和主段。

EXPLANATION OF FIGURES

Immunohistochemical and immunofluorescent expression of VEGF and VEGFR2 proteins in the adolescent rat testis,epididymis and spermatozoa

Fig.1-10:DAB with haematoxyl in counterstain;Fig.11,12:fluorescent stain.Scale=50μm

1:In the testis,VEGF immunoreactive particles were localized in the cytoplasm of spermatogoniums,spermatids,Sertoli cells and Leydig cells;2:VEGFR2 observed in the testis,it was mainly in the forming acrosome of spermatids and Leydig cells.Black and red arrows respectively indicateing Leydig cells and developing acrosome of spermatids.3-6:VEGF was observed in the caput,corpus,cauda and cauda of the epididymis,it strongly expressed in the cytoplasm of principle cells and strongly expressed in the corpus.7-10:VEGFR2 was showed in the caput,corpus,cauda and caput of the epididymis,it expressed in the supranuclear region of the principle cells,but not found in the corpus.Black,green and red arrows indicate the clear cell,basal cell and halo cell respectively,in which VEGF and VEGFR2 immunon-reactive were not detected.11,12:VEGF and VEGFR2 were both localized in acrosome of spermatozoa head and neck,middle and principal segments of spermatozoa tail