葡萄糖对神经干细胞缺氧性损伤保护作用的实验研究

赵舒武 高英茂 汪 涛 王晓玲 魏 斌

(1天津中医药大学基础学院组织胚胎学教研室,天津300193;2山东大学医学院组织胚胎学教研室,济南250012)

缺氧缺血性脑损伤是严重危害人类健康、影响生活质量的常见病和多发病。对缺氧缺血性脑损伤的研究是多年来神经科学中的一个研究热点和难点,对该病的治疗至今仍无重大突破。近年来葡萄糖在缺氧缺血性脑损伤中的作用日益受到关注。葡萄糖对神经组织的营养和保护作用已为人们所熟知,但对神经干细胞缺氧性损伤有无保护作用尚未见报道。本实验利用体外培养的神经干细胞作为细胞模型,在缺氧前后加入不同浓度的葡萄糖,观察神经干细胞的存活、增殖、凋亡及分化情况,以探讨葡萄糖对神经干细胞缺氧损伤的保护作用。

材料和方法

1.实 验动物

雌性成年未经产Wistar大鼠由山东大学西校区实验动物中心提供,常规饲养。

2.实 验试剂

DMEM/F12(1:1) (Hyclone),B27(Invitrogen),碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)和多聚赖氨酸 (Sigma)、胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS,杭州四季青生物技术有限公司),抗nestin IgG(孙晋浩副教授惠赠山东大学医学院),荧光FITC标记二抗 (武汉博士德生物工程有限公司),50%葡萄糖注射液 (山东济南永宁制药有限公司),兔抗人神经元特异性烯醇化酶 (neuron-specific enolase,NSE)多克隆抗体和兔抗人胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗体、PowerVisionTM免疫组化试剂盒和DAB试剂盒 (北京中山金桥生物技术有限公司),AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒 (Sigma)

3.实 验方法

3.1 神经干细胞的培养与鉴定 具体方法见参考文献[1]。

3.2 实验分组

3代神经干细胞,部分接种于含葡萄糖终浓度分别为15mmol/L和30mmol/L的无血清培养基中,放入5%三气培养箱中培养120h,用不含葡萄糖无血清培养基洗涤2-3次,然后接种于正常的无血清培养基中,放入37℃、5%CO2条件下静置培养48h;部分先于5%三气培养箱培养120h,然后分别用含葡萄糖终浓度为15mmol/L和30mmol/L的无血清培养基洗涤细胞2-3次,再接种于含葡萄糖终浓度分别为15mmol/L和30mmol/L的无血清培养基中继于37℃、5%CO2条件下静置培养48h;同时设5%O2120h常糖缺氧组和常糖常氧正常对照组。每组均设复孔,实验重复3次。

3.3 检测指标

3.3.1 干细胞克隆形成率实验

将各组细胞作梯度倍数稀释接种于35mm培养皿中进行缺氧干预。细胞培养7d时,取对照组和各实验组培养皿放置在一张带网格的透明胶片上,在倒置显微镜下计数克隆数,计算公式如下:克隆形成率 (%)=单位面积克隆数/单位面积接种细胞数×100

3.3.2 检测神经干细胞凋亡

分别收集对照和各实验组的神经干细胞,DHank’s液洗涤两次,用binding buffer制备细胞悬液,随即加入 5μlAnnexin Ⅴ-FITC和 10μl PI,室温避光显色15min,激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照,采用机器配套软件计算细胞总数,处于不同凋亡时期的细胞占细胞总数的百分率为凋亡率。

3.4 统计分析

数据以 ¯x±s表示,采用 SPSS统计学软件处理,各组率的比较采用χ2检验法 (Chi-square test),各组均数比较采用t检验或方差分析,多个样本均数两两比较选用 q检验 (Newman-Keuls法)。

结 果

1.培 养细胞的观察

细胞接种24h后见细胞分裂相,细胞饱满,折光性强,第3d有数十个细胞组成的细胞团,呈悬浮状态。随培养时间延长,最终形成由数百个细胞组成的神经球。5%O2120h组中形成神经球数量明显减少,且神经球的细胞折光性较弱,边缘细胞形态不规则或不完整,可见有丝絮状物和较多细胞碎片。缺氧后高糖组 (包括 15mmol/L组和30mmol/L组)神经球的状态与5%O2120h组相比无明显改善。相反,缺氧前30mmol/L葡萄糖组中神经球数量较5%O2120h组显著增多,细胞较丰满,折光性较好,神经球边缘细胞形态较规则,细胞碎片较少。

2.干 细胞克隆形成率检测结果

由图1可见,缺氧前30mmol/L组克隆形成率显著高于5%O2120h组 (P<0.01),但是仍然显著低于正常对照组 (P<0.01);缺氧后各高糖组的克隆形成率与5%O2120h组相比无明显改善(P>0.05)。

图1 缺氧前后高糖对神经干细胞克隆形成率的影响(%)Fig.1 Influence of high glucose on neural stem call before and after hypoxia(%)注:＊P<0.01与正常对照组比较 (Compared with normal control group),△P<0.01与5%O2120h组比较(Compared with 5%O2120h group)

3.细 胞凋亡率检测

激光扫描共聚焦显微镜下显示,缺氧后高糖组和5%O2120h组可见较多的红染和绿染细胞,比较而言,缺氧前30mmol/L高糖组中红染和绿染细胞较少 (图2-4),但仍多于正常对照组。由图5也可得出同样的结果:缺氧后高糖组和5%O2120h组凋亡率显著高于正常对照组 (P<0.01);缺氧前30mmol/L高糖组凋亡率较缺氧后高糖组和5%O2120h组显著降低 (P<0.01),然而仍高于正常对照组 (P<0.01)。

图2 5%O2120h组凋亡免疫荧光双染Fig.2 AnnexinⅤ-FITC/PI staining,showing many apoptotic NSCs in 5%O2120h group图3缺氧前添加30mmol/L葡萄糖组的凋亡免疫荧光双染Fig.3 AnnexinⅤ-FITC/PI staining,showing apoptotic NSCs in 30mmol/L glucose added before hypoxia group图4缺氧后添加30mmol/L葡萄糖组的凋亡免疫荧光双染Fig.4 AnnexinⅤ-FITC/PI staining,showing apoptotic NSCs in 30mmol/L glucose added after hypoxia group

图5 缺氧前后高糖对神经干细胞凋亡率的影响 (%)Fig.5 Influcece of high glucose on apoptotic rate of neural stem cell before and after hypoxia(%)注:＊P<0.01与正常对照组比较 (Compared with normal group),△P<0.01与5%O2120h组比较 (Compared with5%02120h group)

讨 论

缺氧缺血性脑损伤发病率逐年上升,然而人们对其发病机理还不甚明了,更无根本性的治疗措施。近年来葡萄糖在缺氧缺血性脑损伤中的作用日益受到关注。本实验以胚胎11.5天神经干细胞为体外细胞模型,观察缺氧前后分别添加不同浓度的葡萄糖对神经干细胞存活、增殖、凋亡的影响。

结果显示,缺氧前添加足够浓度的葡萄糖可减轻缺氧对神经干细胞的损伤。缺氧前30mmol/L葡萄糖组对神经干细胞缺氧损伤的保护作用显著,而缺氧前15mmol/L葡萄糖组对缺氧损伤的保护作用不明显,分析应该与所给予的葡萄糖浓度不足有关。有文献报道葡萄糖需达到一定的浓度才可起到脑保护的作用。缺氧时,由于能量供应匮乏,细胞可通过 HIF-1调节代谢途径,主要依靠无氧酵解提供ATP。故缺氧前乏糖减少脑能量代谢的底物,不仅可进一步加重脑的功能障碍,而且由此可引起一系列的级联反应加剧脑损伤[2]。葡萄糖除作为能量物质合成ATP外还参与合成代谢,从脑发育开始至脑发育结束葡萄糖都起着极其重要的作用,葡萄糖的供应缺陷将导致脑的发育障碍[3]。有文献报道,在缺氧缺血性损伤时,高浓度葡萄糖可使细胞内乳酸积聚增加数倍,因而加重细胞内酸中毒而加剧脑细胞损伤[4-5]。Young RS等的研究发现虽然高浓度葡萄糖对成体缺氧缺血性脑损伤是有害因素,但对处于发育期动物的缺氧缺血性脑损伤高浓度葡萄糖不会引起细胞内乳酸积聚[6]。我们的研究显示一定浓度的葡萄糖减轻缺氧对体外培养的神经干细胞的损伤,与文献报道不尽一致,分析原因可能为二:其一我们所选取的葡萄糖的浓度范围不够大;其二是我们所选用的细胞模型为大鼠E11.5天神经管神经干细胞,属发育期神经系统细胞,它的生物学特性不能完全等同于成体细胞,另外在体实验与体外培养也会存在一定的差异 。

实验结果还显示缺氧后添加葡萄糖对神经干细胞不能起到保护作用。究其原因可能为因缺氧损伤的细胞其葡萄糖代谢能力已经丧失,即使再添加葡萄糖也不能阻止细胞已启动的程序性死亡途径。

目前关于葡萄糖对缺氧缺血性脑损伤的脑保护作用尚存有争议[7-8]。就目前的研究来看,低血糖的损伤作用和高血糖的保护作用在缺氧缺血性损伤之前可能更为明显。葡萄糖对缺氧缺血性脑损伤的作用可能与细胞的成熟度和来源的部位也存在密不可分的关系。其具体机制有待于进一步深入研究。

〔1〕赵舒武,高英茂,张晓丽,等.钙离子与缺氧性神经干细胞凋亡的相关性研究.中国组织化学与细胞化学杂志,2007,16(5):575-579

〔2〕Vannucci R C,Vannucci SJ.Glucose metabolism in the developing brain.Semin Perinatol,2000,24(2):107-115

〔3〕Medina J M,Tabernero A,Tovar J A,et al.Metabolic fuel utilization and pyruvate oxidation during the postnatal period.J Inher Meta Dis,1996,19:432-442

〔4〕Siesjo BK,Katsura KI,Kristian T,et al.Molecular mechanisms ofacidosis-mediated damage. Diabetes,1996,45(11):1605-1609

〔5〕陈晓红,边连防,伍爱民,等.高糖对缺氧神经元的影响及钙相关机制研究.中国神经科学杂志, 2000,16(4):326-329

〔6〕Young RS,Petroff OA,Aquila WJ,et al.Hyperglycemia and the rate of lactic acid accumulation during cerebral ischemia in developing animals:in vivo proton MRS study.Biol Neonate,1992,61(4):235-242

〔7〕Mc Gowan J E,Marro PJ,Mishra OP,et al.Brain cell membrane function during hypoxia in hyperglycemic new born piglets.Pediatr Res,1995,37:133-139

〔8〕Park W S,Chang Y S,and Lee M.Effects of hyperglycemia or hypoglycemia on brain cell membrane function and energy metabolism during the immediate reoxygenation reperfusion period after acute transient global hypoxia ischemia in the new born piglet.Brain Res,2001,901:102-108