ICAM-1蛋白的表达与大肠癌侵袭转移的相关性

徐胜美 马红梅 郭 东

(广东医学院附属福田医院病理科,深圳518033)

大肠癌 (colorectal carcinoma,CRC)是消化道常见的恶性肿瘤。在美国和多数发达国家,CRC的病死率居癌症病死率的第2位,在全世界范围居第4位[1]。在中国,CRC的发病率位于全部恶性肿瘤的第4-6位,居消化系统的第2-3位。

材料和方法

1 材料

1.1 病例选择收集深圳市福田人民医院普外科2002年1月-2006年12月间经手术切除的102例CRC及正常黏膜组织的石蜡标本。102例CRC患者中,男性66例,女性36例;年龄31-88(平均58)岁;腺癌83例,粘液腺癌15例,印戒细胞癌4例:高分化癌58例,中分化癌25例,低分化癌19例;DukesA期13例,B期43例,C期28例,D期18例;淋巴结转移40例,未转移62例;远处器官转移18例,未转移84例。14例大肠腺瘤取自经结肠镜切除的患者。

1.2 Western blotting的材料本实验收集18例2006年1月至2007年11月深圳市福田区人民医院普外科手术切除的CRC组织标本以及距肿瘤5cm以上的相对照正常大肠黏膜组织标本。标本切取后,部分立即用生理盐水冲洗干净,放入冻存管中,置入-80℃冰箱中保存,用以Western blotting方法检测。

2.方 法

2.1 免疫组化采用SABC法,选用武汉博士德生物工程有限公司提供的ICAM-1(BA0541,1:100)浓缩型一抗和即用型SABC试剂盒 (SA1022)。所有标本经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,切片厚4μm。操作步骤按试剂盒说明书进行。DAB显色,苏木素复染,透明,封固。选用ICAM-1蛋白的典型阳性病例作为阳性对照,阴性对照以PBS缓冲液替代一抗。

2.2 免疫组化的判定标准采用半定量积分法,综合考虑阳性细胞百分率和显色强度来判定结果[2]:计算阳性细胞百分率并赋予分值,≤5%为0分,6%-25%为1分,26%-50%为2分,51%-75%为3分,>75%为4分;观察显色强度并赋予分值,无着色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。两者相乘,0分为 (-),1-12分为 (+)。

2.3 Western blotting组织蛋白提取按照Mammalian Cell Extraction K it试剂盒的操作步骤进行,电泳蛋白样品的制备,SDS-PAGE电泳,半干电转印,免疫反应,用凝胶成像系统拍照留永久的记录。

2.4 Western blotting的判断标准 Western blotting结果显示NC膜上的蛋白质标准品共显出7条蓝色条带,依次为215KD、120KD、84K D、60K D、39.2K D、28K D、18.3KD。同时NC膜上有深紫色的特异性条带出现,即为该蛋白阳性表达,无可见的条带出现即为该蛋白阴性表达。管家蛋白β-actin作为内参照,其检测条带大约在42KD。

3 统计学分析采用SPSS13.0软件对数据资料进行分析。计数资料采用χ2检验或连续性校正χ2检验或Fisher确切概率检验,P<0.05有统计学意义。

结 果

1.ICAM-1蛋白表达免疫组化结果显示ICAM-1蛋白阳性表达以细胞膜弥散或灶状着色为主,细胞质中也有表达 (图1-3)。ICAM-1蛋白在正常黏膜的低表达和腺瘤、癌组织中的高表达,差异均有显著性 (P<0.001,表1)。

表1 各组ICAM-1的蛋白表达T able 1 Protein expressions in each group

2.ICAM-1蛋白在CRC组织中表达与临床病理参数的关系 免疫组化结果显示 CRC组织中ICAM-1蛋白表达水平与患者的年龄和性别无关(P>0.05);随着分化程度的降低,ICAM-1蛋白表达越来越高,但是各组间的差异无显著性 (P>0.05);在临床Dukes分期方面,只有Dukes B与Dukes C、Dukes D期的差异均有显著性 (P<0.01);淋巴结和远处器官转移组中的 ICAM-1蛋白表达均高于未转移组,且差异有显著性 (P<0.01,P<0.05,表2)。

3.ICAM-1的蛋白表达 Western blotting检测发现ICAM-1蛋白的特异性条带出现在Marker标准相对分子量110KD左右,与购买的抗体ICAM-1的相对分子量相符,所有标本的内参βactin都显示清晰的条带,出现在42KD左右 (图4、5和6)。18例CRC组织中 ICAM-1的阳性率为77.8%(12/18);18例正常大肠黏膜组织中ICAM-1的阳性率为16.7%(3/18)。经过 Fisher确切概率法检验,ICAM-1在CRC与正常黏膜组的表达差异有显著性 (P<0.01,表3)。

表2 ICAM-1蛋白在CRC组织中表达与临床病理参数的关系Table 2 Relationship between clinical pathological character and the expression of ICAM-1 in CRL

图1 ICAM-1蛋白在大肠正常黏膜阴性表达 (SABC法×100)图2 ICAM-1蛋白在大肠腺瘤阳性表达 (SABC法×100)图3 ICAM-1蛋白在大肠癌细胞阳性表达 (SABC×200)Fig.1 Negative expression of ICAM-1 protein in normal mucosa,SABC method×100)Fig.2 Positive expression of ICAM-1 protein in adenoma,SABC method×100)Fig.3 Positive expression in CRC,SABC method×200)

表3 ICAM-1在大肠正常黏膜和CRC组织中的表达 (Western bolt)Table 3 Expression of ICAM-1 in normal mucous tissue and CRC(Western blot)

讨 论

肿瘤的侵袭转移是一个动态、复杂、多步骤的过程,涉及到同质性肿瘤细胞之间和异质性肿瘤细胞与宿主细胞的黏附性改变以及细胞外基质的降解。细胞黏附分子是介导细胞间以及细胞与细胞外基质连接的一类跨膜糖蛋白。细胞黏附分子的的种类很多,本实验研究的是与肿瘤侵袭转移密切相关的细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-l)。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成员,广泛表达于单核细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞和肿瘤细胞表面。人 ICAM-1基因定位于染色体 19p13.2-13.3,由一长3.3kb可诱导的mRNA编码,其蛋白的相对分子质量在80-110KD。ICAM-1有膜结合型和可溶性型 (sICAM-1)两型。正常情况下,内皮细胞仅表达少量的ICAM-1,而在炎性因子和炎性介质的诱导下上调,主要作用是调节细胞与细胞间以及细胞与细胞外基质间的黏附作用,此外还参与细胞的信号转导、细胞的生长移行、免疫炎性反应、血管生长和肿瘤的侵袭转移等一系列的生理和病理过程。

既往的研究有两种不同的发现,一种是肿瘤细胞表面 ICAM-1蛋白表达明显减少,如子宫颈癌[3]和小细胞肺癌[4]等肿瘤;另一种是肝癌[5]、胃癌[6]和食管癌[7]等肿瘤细胞中 ICAM-1蛋白表达明显高于正常组织,并且有转移者较无转移者高。先前有人在研究CRC的进展中发现,腺癌的ICAM-1的表达逐渐降低,但间质淋巴管内皮的阳性表达上升,其结果影响了黏附分子ICAM-1介导的同质性或异质性黏附,腺癌的ICAM-1表达逐渐降低可促进癌细胞从肿瘤组织中脱落下来,而淋巴管内皮的阳性表达上升则促使癌细胞黏附于淋巴管内皮细胞,进而侵袭到了淋巴管而实现淋巴道的转移。

实验免疫组织化学研究得出CRC和腺瘤中ICAM-1的表达高于正常黏膜组织 (P<0.001);随着组织分化的降低,ICAM-1呈增高的趋势,但是各组织分化组间的差异均无显著性 (P>0.05),这可能是因为本实验的样本量较小,经过分组后,各组的样本例数更小,未能体现出总体应有的真实水平;而在Dukes分期方面,只有Dukes B期与C、D期的差异均有显著性 (P=0.005,P=0.001);即与淋巴结和远处器官转移则呈正相关。以上的结果提示CRC组织中癌细胞的 ICAM-1蛋白表达增加使其易于发生转移。其可能的机制是ICAM-1是淋巴细胞相关抗原-1的主要配体,当CRC癌细胞表达ICAM-1,此时癌细胞通过这种配体与浸润淋巴细胞结合[8],从而随着淋巴细胞的迁移进入血循环,可能在穿越血管时免受伤害,易于在毛细血管内或淋巴窦滞留和着床,形成转移灶,其表达增强有利于淋巴细胞黏附于血管内皮并向组织中浸润。

目前有关ICAM-1用免疫组织化学检测的研究报道不少,但Western blotting方法研究 ICAM-1表达情况的文章还很少报道。Western blotting有如下优点:⑴具有高度的特异性,在NC膜上进行免疫印迹,利用抗原抗体结合反应的高度特异性来检测ICAM-1蛋白;⑵应用范围广,可进行半定量和定性分析;⑶对组织标本要求低,可应用于冷冻失活组织,故被本实验采纳。本实验采用Western blotting方法发现ICAM-1蛋白在CRC的阳性率明显高于正常黏膜组织,且差异有显著性 (P=0.001),这与免疫组织化学的结果是一致的。Western blotting的结果有力地支持CRC细胞中ICAM-1蛋白的高表达可促进CRC淋巴结和远处器官转移的这种说法。

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