人脐带间充质干细胞分离培养方法的研究

窦慧慧 郭文君 于 丽＊ 马 丽 孙 丽

(1潍坊医学院病理学教研室;2潍坊医学院组织胚胎学教研室,山东;3潍坊市妇幼保健院, 261042)

间充质干细胞 (mesenchymal stem cells,MSCs)是一类起源于中胚层的成体干细胞,因其具有自我更新和多向分化潜能,已成为干细胞研究的热点。目前人MSCs主要来源于成人骨髓和胎儿的脐带血。但是随着年龄的增长,成人骨髓中MSCs的含量逐渐下降[1],并且从足月胎儿的胎血中较难获得MSCs[2]。这使MCSs在临床上的应用受到限制。已有研究发现脐带中也能分离出MSCs[3]。

迄今为止,脐带MSCs尚未得到广泛应用,最关键的原因是脐带MSCs的分离培养技术不是很成熟。另外,在脐带MSCs体外培养中有很多人为因素如选择的培养基、对酶的敏感性、PH值、脐带的新鲜程度等都会影响脐带MSCs的生长。本实验拟从胎龄、脐带的新鲜程度、分离方法和培养基四个方面来探讨脐带MSCs的培养条件,以期获得更高的培养成功率。

材料和方法

1.脐带采集的方法和主要试剂见前期研究[4]

2.脐带MSCs的分离培养 健康足月剖宫产胎儿的新鲜脐带采用组织平铺法[5]分离培养细胞。将组织块剪成1×1×1mm3大小,平铺于培养瓶底,待培养液颜色变化首次全量换液。细胞传代的时间及培养成功的标准同脐血MSCs[4]。

3.胎龄对MSCs原代培养影响 取4份早产儿 (不足37周)和16份足月妊娠脐带,用MesencultTM培养基,分别计算培养成功率。

4.脐带的新鲜程度对MSCs原代培养影响将新鲜脐带分成3段,一段立即用于分离培养细胞,另两段脐带分别放在-20℃和-70℃冻存。次日取出冻存的脐带快速解冻,进行细胞培养。三份脐带均采用组织块平铺法,MesencultTM培养基,每日观察记录。

5.不同分离方法对MSCs原代培养影响 新鲜脐带5份,采用0.25%胰酶消化法,另取新鲜脐带4份,采用双酶法即胰酶加胶原酶消化法。收集细胞,接种到培养瓶中,每日观察记录。与采用组织块平铺法的脐带MSCs培养成功率进行比较。

6.不同培养基对MSCs原代培养影响 16份采用MesencultTM培养基,11份采用DMEM/F12培养基,16份采用L-DMEM培养基,计算并比较培养成功率。

结 果

1.脐 带MSCs生物学特性

接种后24h部分组织块间隙可见纺锤形细胞(图1)。贴壁细胞7d后局部形成集落生长 (图2),14d左右可达80%～90%融合,即可传代。传代后4h细胞贴壁,2d后细胞迅速生长,7d左右可再次传代。随着传代,细胞形成形态相对均一的成纤维细胞样 MSCs,平行排列或漩涡生长,即为脐带MSCs(图3)。MSCs传5代后仍为形态相对均一的成纤维样细胞,细胞融合后仍是平行排列或漩涡生长。

2.胎 龄对脐带MSCs原代培养影响

16份足月分娩脐带均能培养出脐带 MSCs,MSCs增殖旺盛,生长迅速。4份早产脐带虽培养条件相同,但仅1份早产脐带培养1周后组织块间隙见到极少量纺锤形细胞,第2-3天纺锤形细胞消失。其余3份早产脐带培养1月均未见到纺锤形细胞出现。

3.脐 带的新鲜程度对脐带MSCs原代培养影响

-20℃和-70℃冻存的脐带在培养1月左右均未见纺锤形细胞,而新鲜脐带均成功培养出MSCs。

4.分 离方法对脐带MSCs原代培养的影响

足月妊娠分娩的新鲜脐带,采用MesencultTM培养基,其中16份脐带采用组织块平铺法均能培养出MSCs。采用胰酶消化方法和双酶法处理的脐带虽也采用MesencultTM培养基,但未能培养出MSCs。

5.不 同培养基对脐带MSCs原代培养的影响

与MesencultTM培养基比较,DMEM/F12培养基和L-DMEM培养基的细胞生长缓慢,排列稀疏,原代培养时间长 (4-6周)。传代后细胞贴壁慢,增殖也较缓慢。

足月分娩脐带,相同培养条件,其中18份采用MesencultTM培养基,均获得MSCs,培养成功率100%;11份采用DMEM/F12培养基,其中5份获得MSCs,培养成功率45.45%;16份采用DMEM培养基,其中7份获得MSCs,培养成功率43.75%。分别于培养的第4、7、10、14d测定每400倍视野下各组 MSCs的数量,结果发现MesencultTM培养基组脐带MSCs数目较DMEM/F12培养基和L-DMEM培养基组多,且生长迅速(P<0.05)(见表1),差别有统计学意义。

6.表面标记检测 传3代后脐带MSCs高表达CD29、CD90、CD44(图4),几乎不表达造血系标志CD34。与脐血MSCs结果相同,也与已有文献报道相同。

清洁机器人沿所铺设的履带节向前滑动时需要克服两者之间的摩擦阻力以及重力沿工作平面的分量。克服这个摩擦阻力的驱动力由履带节对驱动链轮的反向作用力提供[5]，通过对清洁机器人的受力分析可知：

表1 人脐带MSCs培养中不同培养基的比较 (n=30,¯x±s)T able 1 Comparison of different culture media in the culture of human umbilical cord MSCs(n=30, ¯x±s)

讨 论

间充质干细胞 (MSCs)是来源于胚胎发育早期中胚层的多能干细胞,在特定细胞因子和理化环境的作用下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等[6,7]。MSCs因不受免疫排斥等的限制,近年来在细胞移植和基因治疗等领域备受关注[8,9]。

目前人MSCs的来源多为成人骨髓、脐血,亦有从脐带中分离出MSCs的报道。骨髓MSCs随供者年龄增长数量和增殖分化能力都下降,而且本实验室在前期研究中发现足月儿的脐血中分离出MSCs的成功率仅为66.67%[4],这些都限制了骨髓和脐血MSCs的广泛应用。脐带MSCs采集方便,不会给胎儿及产妇带来痛苦和不利影响并且病毒感染机率低,培养成功率较高,这些优点是骨髓和脐血MSCs无法比拟的。故我们希望找到分离培养脐带MSCs的最佳方法。

胚胎形成过程中,滋养层细胞形成胎膜、脐带、胎盘,内细胞群形成胎儿。Romanov等[10]认为胎儿血循环中MSCs随胎儿的成熟,大部分定位在脐静脉内皮下层和胎盘。这可以部分解释脐带富含MSC的原因。本实验研究发现,足月产胎儿脐带MSCs培养成功率远高于早产儿脐带MSCs培养成功率,这与Romanov的观点相符合。

目前主要是从新鲜组织中分离培养细胞,也有从冻存组织中成功分离培养细胞的报道[12]。本实验将-20℃和-70℃冻存脐带进行MSCs分离培养,计算其成功率,与相同培养条件下新鲜脐带MSCs分离培养成功率相比较,发现新鲜脐带更利于脐带MSCs的分离培养。其原因可能为:(1)MSCs属较原始的细胞,冻存后不易存活;(2)脐带在冻存及解冻过程中与外界接触时间较长,增加了污染的机率;(3)脐带在冻存过程中处理不当,致使大部分细胞活性丧失,从而难以分离培养出细胞。

脐带中的华通胶,由成纤维细胞、胶原纤维和蛋白多糖组成,其内富含MSCs[11],理论上通过胰酶和胶原酶消化可以直接获得脐带MSCs,故本实验采用酶消化法进行脐带MSCs分离培养,但未能成功分离培养出MSCs。采用酶消化法效果不好的原因可能是脐带组织中成分比较复杂,酶难以将其消化,也可能是在用酶消化过程中,酶在消化组织分离细胞的同时将细胞也消化了。其原因有待于进一步探讨。

培养基是影响细胞培养成功与否的一个重要因素。目前用于培养脐带MSCs的培养基大部分为L-DMEM培养基加10%胎牛血清。本实验室在对脐血/带MSCs培养基的研究中,发现采用MesencultTM培养基培养的成功率较高,细胞生长迅速,细胞形态均一,原代培养时间短 (约2～3周),并且能保持MSCs处于未分化状态。而采用DMEM/F12培养基和L-DMEM培养基,脐带MSCs生长缓慢,原代培养时间长 (约 4～6周),这说明MesencultTM培养基是一种更适合脐带MSCs生长的优良培养基。

综上所述,采用新鲜足月分娩脐带和MesencultTM培养基所培养出的MSCs形态较一致,且细胞成分较纯。本实验优化了人脐带MSCs的培养方法,为人脐带MSCs的实验研究和临床应用奠定了基础。

〔1〕Tiu R,Gondek L,O’Keefe C,et al.Clonality of the stem cell compartment during evolution of myelodyspasticsyndromes and otherbone marrow failure syndromes.Eukemia,2007,21(8):1648-1657

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〔12〕Donnez J,Belen MM,Jaoudl P,et al.Ovarian tissue cryopreservation and transplantation:a review.Hum Reprod Update,2006,12(5):519-535

图 版 说 明

图1 原代培养脐带MSCs,接种后24h,MesencultTM培养基 (×200)

图2 原代培养脐带MSCs,接种后7d,MesencultTM培养基 (×200)

图3 传一代脐带MSCs,接种后7d,MesencultTM培养基(×200)

图4 脐带MSCs CD44阳性表达,免疫荧光法 (×400)

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Umbilical cord MSCs in primary culture,cultured for 24h.MesencultTMmedium(×200)

Fig.2 Umbilical cord MSCs in primary culture,cultured for 7d.MesencultTMmedium(×200)

Fig.3 Umbilical cord MSCs in first passage culture,cultured for 7d.MesencultTMmedium(×200)

Fig.4 Umbilical cord MSCs expressing CD44.Immunofluo

rescence method(×400)