TGF-β1对A GS细胞上皮-间充质转化及体外侵袭的影响

2010-02-08韩俊庆王胜昔

中国组织化学与细胞化学杂志 2010年2期

杨帆姜蕊韩俊庆王胜昔宋伟

(山东大学附属省立医院肿瘤研究治疗中心,济南,250021)

胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,患者多死于侵袭、转移。目前研究认为上皮-间充质转化 (epithelial– mesenchymaltransition,EMT)对肿瘤细胞的侵袭和远处转移有重要影响[1]。EMT是指一定条件下上皮细胞在形态上转变成类似间质细胞,同时获得间质细胞的特性,具有活动能力、能够在细胞基质间移动。在分子水平研究发现:发生EMT的上皮性肿瘤细胞,其上皮细胞标志 E-cadherin表达减少或缺失[2],而间质细胞标志N-cadherin却异常高表达[3]。TGF-β1及转录因子Snail被认为通过下调 E-cadherin的表达参与调节EMT。为研究胃癌细胞 EMT现象的发生及其对肿瘤细胞侵袭、转移的影响,我们以胃癌AGS细胞株为研究对象,观察 TGF-β1对AGS细胞形态学变化和增殖的影响,以及对snail、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达和体外侵袭力的影响。

材料和方法

1.材料胃癌细胞株AGS由山东省立医院中心实验室保存,TGF-β1购自美国 Peprotech公司,基质胶Matrigel购自BD公司,Transwell侵袭小室购于Corning公司,兔抗人Snail单克隆抗体购自Abcam公司 (17732),鼠抗 E-cadherin单克隆抗体及鼠抗N-cadherin单克隆抗体均购自北京中杉生物技术公司 (ZM0094);山羊抗兔 IgG(H+L)/FITC和山羊抗小鼠IgG(H+L)/TRITC标记的荧光二抗均购自北京鼎国生物有限责任公司;MTT购自南京大冶生物科技有限公司。

2.方法

2.1 细胞培养 AGS用含 10%胎牛血清,100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的 1640培养基,常规培养于5%CO2,37℃人工培养箱中,每2-3d传代一次。

2.2 细胞形态学观察 10ng/ml TGF-β1处理细胞,连续培养3代以后,于倒置显微镜下观察细胞形态学的变化。

2.3 MTT比色法收集对数生长期细胞,以每孔5000个细胞接种于96孔板,每孔终体积为100μl,于5%CO2,37℃条件下培养。待细胞完全贴壁后,进行分组,设:①空白对照组:无 TGF-β1;②实验组:分别加入 1、2、5、10、20、50ng/ml六组终浓度的 TGF-β1,且每一组设6个复孔,培养24h。终止培养前4h每孔加入 MTT 20μl,孵育完毕后吸除孔内上清液,每孔加入150μl DMSO,微型振荡器振荡10min,使紫色结晶物充分溶解。以空白对照孔调整零点,酶联免疫分析仪上测定490nm波长处每孔吸光的光密度值。以上试验重复3次,以每组平均光密度值 (MOD)代表细胞增殖能力的大小。

2.4 细胞划痕试验 AGS细胞接种于6孔培养板中 (细胞数约为每孔2×105个),待长到完全融合时,用200μl微量移液枪头在6孔板内单层细胞上垂直划痕,划痕后用 PBS冲洗2次,同时在实验组中加入10ng/ml的 TGF-β1,继续培养。每24 h于倒置显微镜下观察划痕愈合程度并拍照。

2.5 Transwell侵袭试验应用24孔 Transwell侵袭小室进行侵袭试验,将Matrigel胶以1:3比例用无血清1640稀释后,取50μl铺于 Transwell上室中,置于37℃培养箱中,5h后,待上室的聚碳酸酯膜-Matrigel聚合后,收集对数生长期AGS细胞,以200μl无血清培养基制成单细胞悬液加入上室孔中,细胞浓度为1x105个/孔,下室中加入含有10%胎牛血清的完全培养基,实验组加入终浓度为10ng/ml的 TGF-β1,对照组加入等量PBS作为趋化剂,培养24h。培养结束后取出Transwell小室,将上室中的Matrigel胶和附着的细胞用湿棉签擦去,4%冰多聚甲醛固定,苏木素染色,高倍镜下计数膜背面上的穿膜细胞数。

2.6 免疫荧光检测snail、E-cdaherin和N-cadherin的表达将对数生长期的AGS细胞制备细胞爬片,实验组加入10ng/ml TGF-β1,48h后取出,4%冰多聚甲醛固定30min,常规免疫荧光染色,一抗分别为兔抗人 Snail(1:800)、鼠抗 E-cadherin单克隆抗体和鼠抗N-cadherin单克隆抗体。一抗4℃过夜后,加入特异性荧光二抗,37℃孵育2h,DAPI染细胞核。阴性对照试验中,用PBS代替一抗以排除非特异性的二抗结合。

2.7 Western blot 以平皿常规培养A GS细胞,其中实验组加入10ng/ml的 TGF-β1,48h后收集细胞,加入适当细胞裂解液,冰浴30min,离心取上清,Brandford比色法测定蛋白质浓度后,取30μg样品进行SDS-PAGE,电泳完毕后,应用电转仪将样品转移至 PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,兔抗人Snail(1:800)、鼠抗 E-cadherin单克隆抗体和鼠抗N-cadherin单克隆抗体4℃孵育过夜,洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的特异性二抗37℃孵育1h,洗膜后加入DAB显色。以内参 (βactin)作为阳性对照,凝胶图象处理系统成像。

2.8 统计学处理结果应用SPSS 17.0统计学软件处理系统,所有数据均以均数±标准差 (¯x±s)表示,采用单因素方差分析,P<0.05认为有显著性差异。

结果

1.T GF-β1对AGS细胞形态变化的影响

在10ng/ml TGF-β1刺激后,通过相差显微镜观察到AGS细胞失去上皮细胞的多边样形态,表现为类似成纤维细胞,部分细胞呈梭形,细胞的排列较为杂乱 (图1A)。

2.T GF-β1对AGS细胞增殖的影响

低浓度 (1、2、5、10ng/ml)TGF-β1促进细胞增殖,在10ng/ml时作用最强,而高浓度 (20、5 0ng/ml)TGF-β1时细胞增殖率逐步降低,且呈剂量依赖性 (图2)。

3.细胞迁移力的改变划痕后,与对照组相比,加入10ng/ml TGF-β1继续培养的实验组,细胞迁移能力明显增强。同样的,应用未铺Matrigel胶的 Transwell侵袭小室进行细胞迁移试验,结果也发现10ng/ml TGF-β1作用的实验组细胞迁移能力与对照组比较大大增强 (图3)。

4.Transwell体外侵袭试验 Transwell小室培养细胞24h后,AGS细胞穿膜细胞数为58.33±5.859,实验组穿膜细胞数为105.67±4.041,两者相比差异具有显著性 (P<0.05)(图1 B)。

5.TGF-β1作用后 Snail及上皮、间质标志蛋白的改变免疫荧光和 Western-blot检测发现,与对照组相比,加入 10ng/ml TGF-β1作用后,Snail蛋白表达增强,E-cadherin表达下降,而N-cadherin表达升高。然而,应用免疫荧光未检测到E-cadherin的表达 (图1 C,D;图4)。

讨论

以往研究中证实大量的生长因子可以诱导发生EMT[2],其中 TGF-β1是目前研究最广泛细胞因子之一[4]。Bakin AV[5]等将NmuMG乳腺上皮细胞暴露在外源性 TGF-β1中,发现细胞呈现梭形形态,E-cadherin等细胞间粘附分子表达下调,而伴随侵袭能力的增强,具有EMT样表型。特别注意的是TGF-β1在肿瘤发展中扮演着双重角色[6]:一方面,它作为肿瘤生长抑制因子,抑制肿瘤细胞的增殖;另一方面,在肿瘤的侵袭和转移过程中,TGF-β1却起促进肿瘤生长的作用,同时可以诱导细胞发生 EMT,间接促进其侵袭、转移。本研究发现,低浓度 (1、2、5、10ng/ml)TGF-β1对胃腺癌细胞株AGS具有促进增殖的作用,在10ng/ml时作用最大;而较高浓度 (20、50ng/ml)TGF-β1时细胞增殖逐步降低。

上皮细胞发生 EMT现象后,其细胞-细胞之间连接减弱、重要的细胞骨架发生重组、细胞极性丧失,最终导致细胞形态发生改变;同时获得运动和侵袭能力[7],从而发生侵袭和转移。本研究通过外源性 TGF-β1作用于胃腺癌细胞株AGS,使AGS由常规培养条件下的多边样上皮形态,转变成类似间充质细胞样形态,在形态学上证实了EMT的改变。已有多个研究证明上皮来源的肿瘤细胞发生EMT现象后,细胞的侵袭力增强,本研究通过细胞划痕试验和 Transwelll侵袭试验也证实了这一点。我们应用免疫荧光和Western blot检测转录因子Snail和细胞间粘附分子发现:胃癌细胞AGS发生EMT现象后,其细胞间粘附分子E-cadherin表达下调,而N-cadherin和 Snail表达上调。

E-cadherin、N-cadherin同属经典的钙粘蛋白家族,主要参与细胞间连接,二者与肿瘤的侵袭、转移关系密切,其中 E-cadherin的表达下调或缺失,被认为是 EMT的标志。Snail是一种锌指蛋白转录因子,在胚胎发育和肿瘤发展过程中,可以诱导EMT的发生。Snail通过与靶基因上含有的CAGGTG碱基序列的 E-box作用元件结合,发挥转录抑制作用,从而调节其表达[8]。目前认为 ECadherin是Snail直接作用的靶基因,Snail通过抑制E-Cadherin的表达,减少细胞间的粘附连接,从而使上皮细胞发生转化,获得间充质细胞特性。而 TGF-β1可以通过 PI3K信号通路,诱导 A KT的激活,介导Snail的表达上调和 E-cadherin的表达下调[9]。本研究通过 TGF-β1作用于AGS细胞株后,检测发现了 Snail的表达上调,也证实了TGF-β1可能通过介导 Snail的表达,促进细胞发生EMT,而增强侵袭和迁移的能力。

EMT是一个可逆的过程,目前已有研究应用干扰 TGF-β1、Snail等基因的表达,及重新表达E-cadherin等基因的方法来逆转 EMT过程,从而降低肿瘤的侵袭和转移能力,这可能为肿瘤的临床治疗提供一个新的思路。

〔1〕 Yilmaz M,Christofori G. EMT,the cytoskeleton,and cancer cell invasion.Cancer Metastasis Rev,2009,28(1-2):15-33

〔2〕Voulqari A,Pintzas A.Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis:Mechanisms,markers,and strategies to overcome drug resistance in the clinic.Biochim Biophys Acta,2009,21:1-16

〔3〕Nakajima S,Doi R,Toyoda E,et al.N-cadherin expression and epithelial-mesenchymal transition in pancreatic carcinoma. Clin Cancer Res,2004,10 (12 Pt1):4125-4133

〔4〕Zavadil J,Bottinger EP.TGF-beta and epithelial-tomesenchymal transitions.Oncogene,2005,24(37):5764–5774

〔5〕Bakin AV,Tomlinson AK,Bhowmick NA,et al.Phosphatidylinositol 3-kinase function is required for transforming growth factor beta-mediated epithelial to mesenchymal transition and cellmigration. JBiol Chem,2000,275(47):36803–36810

〔6〕Larue L,Bellacosa A.Epithelial-mesenchymal transition in development and cancer:role of phosphatidylinositol 3’Kinase/Akt pathways.Oncogene,2005,24(50):7443-7454

〔7〕Shook D,Keller R.Mechanisms,mechanics and function of epithelial–mesenchymal transitions in early development.Mech Dev,2003,120(11):1351–1383

〔8〕Cano A,Perez-Moreno MA,Rodrigo I,et al.The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.Nat Cell Biol,2000,2(2):76-83

〔9〕Rahimi RA,Leof EB.TGF-beta signaling:a tale of two responses.J Cell Biochem,2007,102(3):593–608

图版说明

图1 A.TGF-β1对AGS细胞的形态学影晌。×400

B.Transwell侵袭试验结果。×200

C.免疫荧光检测Snail表达结果。×400

D.免疫荧光检测N-cadherin表达结果。×200

1.对照组;2.10ng/ml TGF-β1实验组

图2不同浓度 TGF-β1对AGS增殖的影响

图3细胞划痕试验结果

1.对照组;2.10ng/ml TGF-β1实验组。

图4 Snail、N-cadherin及 E-cadherin蛋白质印迹结果1-2.对照组;3-4.10ng/ml TGF-β1实验组。

EXPLANATION OF FIGURES