限制性高脂饮食对大鼠多个器官Cx43表达的影响

谢雪梅 余上斌 刘声远 邹聪敏 杜 颖 马万里 朱莉萍 赵建红 叶 红＊

(1华中科技大学同济医学院病理生理系,武汉,430030 2华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科,武汉,430022)

缝隙连接是细胞间连接方式的一种,由缝隙连接蛋白 (connexin,Cx)所构成。相邻细胞间通过缝隙连接所介导的细胞缝隙连接通讯 (gapjunction intercellular communication,GJ IC)进行着信息和能量物质的交换,参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联,对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。Cx广泛分布于哺乳动物组织,在不同的细胞、组织和种族中有不同的表达。其中,Cx43是Cx家族中分布最广的分子,几乎对所有组织细胞都有调控作用。Cx43在脂肪细胞的形成中起重要作用,小干扰RNA使Cx43表达下调,可抑制脂肪细胞的形成[1]。在高胆固醇血症和动脉粥样硬化的动物模型均可见Cx43表达上调,其升高的机制与高脂血症、机械损伤和炎症反应有关,降低Cx43表达可减轻动脉粥样硬化斑块的形成[2,3,4,]。但也有报道喂饲富含胆固醇的饮食引起的高胆固醇血症会导致心肌Cx43蛋白表达下调,从而抑制心肌的收缩功能[5]。表明 GJ IC和Cx43与脂肪代谢有关系,但限制性高脂饮食 (脂肪含量高,热量摄入与对照一致)对Cx43表达的影响,目前未见报道。本实验通过给予动物高脂饮食,但控制其热量摄入量与普通饲料一致,来初步探索限制性高脂饮食对Cx43表达的影响。

材料和方法

1.实验动物及分组 选1个月左右健康Wistar大鼠54只 (由同济医学院实验动物中心提供),体重120±10 g,雌雄各半,在18-21℃环境温度与80%的湿度自由饮水的条件下饲养7d后,随机选取雌雄20只为普通饲料喂养组 (雌.雄各半),16只为限制性高脂饲料喂养组 (雌、雄各半),平均体重为150.30±5.40g。

2.限制性高脂饮食配方 普通基础饲料由同济医学院动物中心提供,每100g饲料总能量为1451.2 kJ,每天每100g大鼠的平均喂饲量为10g。高能高脂饲料按100 g基础饲料,加酪蛋白10g、猪油 38.63g、淀粉 39.63g、KCl 1.01g、NaCl 1.25g、MgCl21.09g、混合维生素 (21世纪金施尔康-混合维生素,上海强生制药厂)1.0g、豆油8.0g的比例配置,每100g饲料总能量为2586.5 kJ,每天每100g大鼠的平均喂饲量为6g,喂饲13周。两种饲料喂养组的热量摄入基本一致。

3.体重测量及动物处理 各组动物每7d测量并记录体重1次。动物喂饲13周后,测量体重和体长后,计算Lee’s指数= [体重 (g) ·1000]3体长 (cm)。然后分别处死采集心脏血2ml,离心1 500 r/min×5 min,收集血浆测定血糖与血脂水平,并分别取出脑、心、肝、胰、肾、睾丸组织用中性甲醛溶液固定,石蜡包埋。

4.血糖与血脂水平的检测 血浆葡萄糖浓度的检测采用葡萄糖液体试剂盒 (己糖激酶法)(德塞诊断系统上海有限公司),操作步骤:将“试剂1”4份加“试剂2”1份混合成单试剂,10μl样品/空白对照/标准品加入1000μl单试剂,37℃反应5min,用雅培 AEROSET全自动生化分析仪(4000型)检测,波长340nm,30min内记录吸光度,仪器直接报告结果,结果以mmol/L表示。血浆总胆固醇的检测采用总胆固醇液体试剂盒 (酶试剂法)(德塞诊断系统上海有限公司),操作步骤:10μl样品/空白对照/标准品加入 1000μl试剂,37℃反应10min,用雅培AEROSET全自动生化分析仪 (4000型)检测,波长500nm,60min内记录吸光度,仪器直接报告结果,结果以mmol/L表示。甘油三酯液体试剂盒 (酶试剂法)(德塞诊断系统上海有限公司),操作步骤:10μl样品/空白对照/标准品加入 1000μl试剂,37℃反应10min,用雅培 AEROSET全自动生化分析仪(4000型)检测,波长500nm,记录吸光度,仪器直接报告结果,结果以mmol/L表示。

5.HE染色 取石蜡切片,60℃烤2h,二甲苯脱蜡,酒精梯度脱水后,常规 HE染色。

6.免疫组化染色及图像分析 取石蜡切片,60℃烤2h,二甲苯脱蜡,酒精梯度脱水,PBS洗,3min×3次;0.3%TritonX-100室温孵育20min;3%H2O2室温孵育15min,以灭活内源性过氧化物酶;10%山羊血清封闭,室温30min;甩去多余液体,不洗;加入1:100稀释的兔抗鼠connexin-43亲和纯化多克隆抗体 (Santa Cruz,USA),4℃过夜,0.01mol/L PBS洗5min×3次;滴加生物素化羊抗兔 IgG,37℃45min;0.01mol/L PBS洗5min×3次;滴加 SAB试剂,37℃20min;0.01mol/L PBS洗5min×4次;DAB显色,蒸馏水洗涤;苏木素轻度复染,脱水、透明、封片;用Image pro-plus显微图像分析系统分析Cx43的阳性颗粒的平均光密度反应蛋白质表达水平。

7.统计学处理所有数据均以¯x±s表示,两样本均数间比较用t检验,以 P<0.05为有显著性差异。

结 果

1.限 制性高脂饲料喂养组与普通饲料喂养组大鼠体重及Lee’s指数

大鼠体重及Lee’s指数

大鼠分别用限制性高脂饲料和普通饲料饲喂13周后,测量大鼠体重及Lee’s指数,结果显示,雌性和雄性限制性高脂饲料喂养组大鼠体重及Lee’s指数与普通饲料喂养组差异无显著性意义(P>0.05)(见图 1)。

图1 限制性高脂饲料喂养组与普通饲料喂养组大鼠体重及 Lee′s指数Fig.1 Body weight and Lee′s index in restricted high fat feeding and control groups.

2.限 制性高脂饲料喂养组与普通饲料喂养组大鼠血脂、血糖水平

分别用限制性高脂饮食和普通饲料饲喂13周后,抽血检测血浆总胆固醇、甘油三脂和葡萄糖水平,结果显示,雌性和雄性限制性高脂饲料喂养组与普通饲料喂养组差异无显著性意义 (P>0.05)(见图 2)。

图2 限制性高脂饲料喂养组与普通饲料喂养组大鼠血浆总胆固醇、甘油三脂和葡萄糖水平Fig.2 Plasma glucose,total cholesterol and triglyceride in restricted high fat feeding and control groups.

3.限 制性高脂饮食大鼠脑、肝脏、肾脏、胰岛及睾丸Cx43蛋白的表达

3.1 脑Cx43蛋白的表达

在大鼠大脑皮质的神经元细胞中,雌性普通饲料组大脑皮质未发现有Cx43蛋白表达,雌性限制性高脂饲料组大脑皮质部分神经元细胞胞浆中及突起可见有明显表达,二者有显著性差异 (P<0.01);而雄性普通饲料组和限制性高脂饲料组大脑皮质的神经元细胞胞浆中都有Cx43散在表达,两组间无显著性差异 (P<0.01)(图3,表1)。

在大鼠海马区域的神经元细胞的胞浆、树突、轴突中都有Cx43表达,雌雄大鼠限制性高脂饲料喂养组均明显高于普通饲料组 (P<0.01)(图3,表1)。

3.2 肝脏Cx43蛋白表达

Cx43在大鼠肝门管区周围肝细胞胞浆中散在表达,雌性大鼠限制性高脂饲料喂养组明显高于普通饲料组 (P<0.01);雄性正好相反,限制性高脂饲料喂养组明显低于普通饲料组 (P<0.01);而且雄性普通饲料组的表达明显高于雌性 (P<0.01)(图 3, 表 1)。

在肝中央静脉周围的肝细胞中Cx43散在表达,雌性大鼠限制性高脂饲料喂养组明显高于普通饲料组 (P<0.01),雄性正好相反,限制性高脂饲料喂养组明显低于普通饲料组 (P<0.01);而且雄性普通饲料组的表达明显高于雌性 (P<0.01)(图 3, 表 1)。

3.3 肾脏Cx43蛋白的表达

Cx43在大鼠肾皮质近球小管上皮细胞胞浆中散在表达,雌雄大鼠限制性高脂饲料喂养组均明显高于普通饲料组 (P<0.01),而且雄性普通饲料组的表达明显高于雌性 (P<0.01)(图3,表1)。

在髓袢粗段肾小管上皮细胞,Cx43呈现弥散表达,雌性大鼠限制性高脂饲料喂养组明显高于普通饲料组 (P<0.01),雄性正好相反,限制性高脂饲料喂养组明显低于普通饲料组 (P<0.01)(图3,表1)。

3.4 胰岛Cx43蛋白表达

Cx43在胰岛细胞有表达,雌性大鼠限制性高脂饲料喂养组明显低于普通饲料组 (P<0.05),雄性正好相反,限制性高脂饲料喂养组明显高于普通饲料组 (P<0.05);而且雌性普通饲料组的表达明显高于雄性 (P<0.01)(图3,表1)。

3.5 睾丸Cx43蛋白的表达变化

Cx43在雄性大鼠睾丸生精小管间质细胞中散在表达,限制性高脂饲料喂养组明显高于普通饲料组 (P<0.05)(图 3,表 1)。

表1 限制性高脂饲料喂养大鼠各器官的Cx43蛋白表达Table 1 Cx43 protein expression of restricted high fat feeding rats in some organs

讨 论

研究给大鼠喂饲高脂饲料,但控制高脂饲料的摄入量,使之与普通饲料组平均摄入热量一致,结果喂饲13周后,大鼠的体重和Lee’s指数与对照无明显差异,说明没有导致肥胖,血浆总胆固醇、血浆甘油三酯和血糖水平也与对照一致,说明没有引起高血糖和高血脂,因此限制性高脂饮食的大鼠模型复制成功[6]。

Cx43是Cx家族中分布最广的分子,几乎对所有组织细胞都有调控作用。Cx43是神经胶质细胞缝隙连接的主要成分,在神经元的形成、迁移中发挥重要作用。Cx43的表达减少可减弱神经元的生长。Cx43基因敲除的小鼠,显示运动能力的改变,脑内神经递质水平的变化,脑缺血后凋亡和炎症增加,对缺氧预适应不敏感[7,8]。Cx43在肝脏主要表达于肝非实质细胞,如 Kupffer’s细胞,胆管上皮细胞和内皮细胞等[9,10],与细胞的生长控制有关,生长因子或促瘤剂处理会导致缝隙连接蛋白表达降低[11]。在肾脏的研究显示,ATP去除导致的缝隙连接半通道的活化介导肾小管上皮细胞的损伤[12]。Cx43是胰岛素分泌细胞之间连接通道的主要成分,刺激胰岛B细胞分泌的因素同时可导致Cx43表达增加[13,14]。 缝隙连接在精子生成中发挥关键作用。在血-睾屏障中,Cx43和桥粒蛋白plakophilin-2(PKP2)形成蛋白复合物调节血-睾屏障的细胞黏附,有利于原始精母细胞的通过[15,16,17]。

研究检测了Cx43蛋白在上述器官的表达,发现Cx43蛋白的表达存在明显的性别差异,在肝门管区和中央静脉周围和肾脏近球小管上皮细胞,雄性普通饲料组Cx43的表达明显高于雌性,而胰岛细胞则是雌性高于雄性。以上结果提示,性别影响了大鼠体内某些器官Cx43的表达。据报道Cx43的表达受性激素雌二醇和睾酮的调节[18]。但其具体机制有待进一步探讨。研究结果显示,在雌性大鼠中,上述器官除胰岛外,均是限制性高脂饲料组的Cx43表达量强于普通饲料组;在雄性大鼠中,则观察到海马区的神经元细胞和肾近球小管上皮细胞及胰岛细胞的Cx43表达是限制性高脂饲料组强于普通饲料组,而在肝门管区、肝中央静脉周围的肝细胞和髓袢粗段肾小管上皮细胞Cx43表达是限制性高脂饲料组弱于普通饲料组。以上结果提示,限制性高脂饮食可影响大鼠某些器官Cx43的表达,有性别差异。

研究结果显示限制性高脂饮食喂养大鼠,由于控制了其饲料摄入量,因而其体重、Lee’s指数、血糖、血脂水平与对照组无明显差异,但Cx43的表达在不同器官出现上调或下调,提示限制性高脂饮食引起的Cx43表达变化可能是多种机制的综合作用。炎症反应是导致Cx43表达上调的重要机制,有报道在肝 Kupffer’s细胞和脑星形胶质细胞,炎症因子可引起Cx43表达上调[9,19]。限制性高脂饮食也可能是由于饮食结构的改变而影响代谢相关激素如胰岛素、肾上腺髓质素等的分泌而影响Cx43的表达[20,6]。

研究结果表明,限制性高脂饮食可以改变大鼠体内某些器官的Cx43的表达,从而影响器官功能。该研究可能为某些疾病的发病机制的阐明和防治提供新思路。

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图3 限制性高脂饲料喂养大鼠各器官Cx43蛋白的表达 (免疫组织化学染色,棕色为阳性颗粒,标尺=50μm)Fig.3 Cx43 protein expressionin some organs in female and male restricted high fat feeding and control rats(Immunohistochemistry staining,Bar=50μm)

图3 限制性高脂饲料喂养大鼠各器官Cx43蛋白的表达 (免疫组织化学染色,棕色为阳性颗粒,标尺=50μm)Fig.3 Cx43 protein expressionin some organs in female and male restricted high fat feeding and control rats(Immunohistochemistry staining,Bar=50μm)