气相色谱法测定灵芝多糖中的有机溶剂残留量

郝 锐， 曹 芳， 周海斌， 张朝晖*

(1.江苏大学药学院，江苏镇江212013;2.南京长澳医药科技有限公司，江苏南京210038)

样品是从我国传统药材赤芝Ganoderma Lucidum(leyss.ex Fr.)Karst.子实体经粉碎，沸水提取，浓缩，乙醇分级沉淀等步骤得到。灵芝多糖是灵芝的主要生物活性成分，存在于天然灵芝子实体、孢子粉和菌丝体中，是灵芝扶正固本的有效成分，具有抑制肿瘤，提高机体免疫力，消除自由基，抗血栓，降血糖等作用。

由于该药物在制备和精制过程中使用了乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂［1］，故对此3种溶剂的残留量进行检测以保证产品质量，对改进生产工艺也有指导作用。本实验参考中国药典［2］气相色谱法测定有机溶剂残留的相关规定进行了以下实验。

1 仪器与试药

日本岛津GC2010型气相色谱仪，配有氢火焰离子化检测器，岛津GC Solution工作站，日本岛津公司。电子天平METTLER TOLEDO XS105，精确到十万分之一克，瑞士梅特勒-托利多公司。赤芝药材来源于安徽省旌德县黄山灵芝绿色基地绿色生态产业园，经江苏大学药学院张朝晖教授鉴定为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma Lucidum(leyss.ex Fr.)Karst.的干燥子实体。灵芝多糖样品(南京长澳医药科技有限公司，批号 20080911、20080923、20081012);乙醇(分析纯)，丙酮(分析纯)，正丁醇(分析纯)，乙酸乙酯(色谱纯)，二甲亚砜(色谱纯)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:DB-624(30 m ×0.25 mm ×1.4 μm，固定液:6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷)。柱温起始为40℃，维持2 min，以20℃/min升至100℃，维持6.5 min，以50℃/min升至230℃，维持5 min。进样口温度:260℃，检测器温度:260℃。载气为高纯氦。分流比为40∶1。检测器:FID(空气流速:400 mL/min，氢气流速:40 mL/min)。进样量:1 μL。

2.2 溶液的配制

取4个25 mL量瓶，先各加入适量的二甲亚砜，然后往各量瓶分别精密加入乙醇125.5 mg，丙酮125.2 mg，正丁醇126.0 mg，乙酸乙酯125.8 mg，再加二甲亚砜溶解并稀释至刻度，充分摇匀，作为储备液。

2.3 系统适应性试验

准确量取各贮备液1.0 mL于一个10 mL量瓶中，用二甲亚砜定容至刻度，充分摇匀后进样1 μL，结果如图1所示，各峰保留时间分别为乙醇3.927 min，丙酮4.339 min，乙酸乙酯5.893 min，正丁醇7.216 min。各色谱峰分离良好，专属性强。

图1 对照液气相色谱图

2.4 线性试验

精密吸取上述贮备液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 分别置于5个100 mL量瓶中，各加乙酸乙酯1.0 mL作为内标，用二甲亚砜定容，充分混匀，进样1 μL。计算得各待测溶剂的回归方程，结果见表1。

表1 线性关系试验结果

2.5 方法精密度试验

精密吸取上述贮备液各1.0 mL，精密吸取内标乙酸乙酯贮备液1.0 mL，加入100 mL量瓶中，用二甲亚砜定容到刻度，充分摇匀，进样1 μL，连续进样6次，计算得乙醇，丙酮，正丁醇的峰面积和内标乙酸乙酯的峰面积比结果RSD分别为1.09%、1.42%、3.42%(n=6)。

2.6 最低检测限

配制一定浓度的含各待测有机溶剂的溶液，逐级稀释进样测定，经测定得到本方法对该3种有机溶剂的最低检测浓度(S/N=3)结果为:乙醇0.752 8 μg/mL、丙酮0.751 3 μg/mL、正丁醇 0.755 9 μg/mL。

2.7 样品测定

分别精密吸取各贮备液1.0 mL，内标液1.0 mL，加入100 mL量瓶中，用二甲亚砜定容至刻度，充分摇匀，作为对照溶液。

另取3批灵芝多糖样品各约100 mg，精密称定，分别加入3个10 mL量瓶中，并且各精密吸取内标液0.1 mL，用二甲亚砜定容至刻度，充分摇匀作为供试液。结果见图2。

图2 样品气相色谱图

测定法:取对照溶液与供试品溶液各1.0 μL分别进样，记录色谱图，供试品溶液色谱图如显有机溶剂峰，按内标法以峰面积计算含量。

批号为20080911、20080923、20081012的3批样品中，丙酮、正丁醇均未检出;乙醇的含量分别为0.105 9%、0.112 6%、0.109 6%，均低于乙醇的限度要求。(中国药典2005年版明确规定了药品中常见的残留溶剂及限度，其中丙酮、正丁醇、乙醇的限度均为0.5%［2］。)

2.8 回收率试验

分别精密吸取各贮备液1.0 mL，内标液1.0 mL，加入100 mL量瓶中，加二甲亚砜定容至刻度，充分混合均匀后作为对照液。精密称取6份样品各约1 g于100 mL量瓶中，在每份中加入各贮备液1.0 mL，内标液1.0 mL，用二甲亚砜定容至刻度，充分混匀后进样1 μL。计算各溶剂峰和内标峰的峰面积比，测得各溶剂的回收率分别为乙醇102.8%，丙酮101.6%，正丁醇103.4%，RSD分别为1.57%，0.89%，2.02%。

3 讨论

3.1 在本试验中柱温的选择是关键，测定时采用程序升温的方法以改善峰形和加快出峰速度。先在40℃保持2 min，使低沸点组分先流出，然后逐渐升温至100℃保持6.5 min，加快高沸点组分出峰，有助于改善峰形。最后在230℃保持5 min，使溶剂峰充分排出。

3.2 实验采用乙酸乙酯为内标测定3种有机溶剂的残留量，色谱图显示溶剂、内标以及待测组分间能基线分离，无干扰;方法操作简便快速，重现性和准确度较好，线性、检出限和精密度等均满足定量分析的要求，适用于灵芝多糖中残留溶剂的检测。

3.3 因为灵芝多糖是水溶性药物，且在水、二甲亚砜中溶解性都很好，但待测定的有机溶剂正丁醇在水中的溶解性不好，根据药典要求，选用高沸点的二甲亚砜做溶剂，结果良好，故选择二甲亚砜做溶剂。

［1］周海钧.药品注册的国际技术要求［M］.北京:人民卫生出版社，2000:82-99.

［2］中国药典［S］.二部.2005:附录54-57.