响应面法优化超声波辅助提取香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的工艺

刘 莹，袁 岩，雷霄宇，黄 文，王 益*

(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

香菇由于其营养价值和药用价值高，深受消费者喜爱，然而进入新世纪以来，香菇中甲醛超标导致的食品安全问题困扰着香菇产业的发展。日本学者Yasumoto[1-4]、Iwami[5]和Fujimoto[6]等在研究香菇特征风味形成机理的过程中发现香菇可以产生内源型甲醛，并且是香菇特征风味物质酶学代谢途径的副产物，半胱氨酸亚砜裂解酶(C-S lyase)是该酶学代谢途径中的一种关键酶。

目前，对香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的研究不够深入，不能为香菇内源型甲醛的调控提供理论依据。对香菇内源型甲醛进行调控，必须明确香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的基本酶学性质和结构，获得足量的半胱氨酸亚砜裂解酶是对其基本酶学性质和结构进行研究的前提。由于香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的含量较低，一般为1%左右[6]，且半胱氨酸亚砜裂解酶存在于香菇细胞内，常规静止浸提方法的提取率较低而且耗时，容易造成酶活损失。据文献报道利用超声波技术提取生物酶具有提取时间短、原料利用率高、酶不易失活等优点[7-11]。本实验采用超声波辅助法提取香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶，在单因素试验基础上，采用响应面分析的方法对半胱氨酸亚砜裂解酶的提取工艺进行优化。半胱氨酸亚砜裂解酶提取工艺的确定，为深入研究该酶的酶学性质提供条件，从而为香菇内源型甲醛的调控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜香菇由华中农业大学应用真菌研究所提供；S-甲基-L-半胱氨酸亚砜、2,4-二硝基苯肼 美国Sigma公司；Tris-base 韩国Biosharp公司；其余试剂均为国产AR级。

1.2 仪器与设备

UV-1700型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Avanti J-E型冷冻离心机 美国Beckman公司；US3120DH型超声波清洗器 北京优晟联合科技有限公司；Waring组织粉碎机 德国Karl Kolb公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的提取方法

精确称取10.0g新鲜香菇于组织捣碎机中，加入一定量的0.1mol/L的Tris-HCl (pH 7.6) 缓冲液进行匀浆处理5min。将匀浆液置于250mL三角瓶中，用超声波辅助法提取半胱氨酸亚砜裂解酶，提取液经10000×g离心处理之后，取上清液测定酶活，计算提取率。

1.3.2 半胱氨酸亚砜裂解酶的酶活测定方法及提取率的计算

半胱氨酸亚砜裂解酶催化S-甲基-L-半胱氨酸亚砜生产丙酮酸，酶活性由丙酮酸的生产量反映[12]。反应体系为0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.4)缓冲液2mL、酶液0.2mL、4.0μmol/mL底物0.2mL，在具塞试管中于37℃反应5min后立即加入0.4mL 10%三氯乙酸终止反应，加入1mL 2,4-二硝基苯肼，37℃保温5min，然后加入5mL 2.5mol/L NaOH溶液，反应10min后于520nm波长处比色。以缓冲液、钝化酶、底物、三氯乙酸、2,4-二硝基苯肼、NaOH反应体系为空白。酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟产生1μmol丙酮酸定义为一个酶活力单位(U)。

半胱氨酸亚砜裂解酶提取率/(U/g)＝样品半胱氨酸亚砜裂解酶活性/香菇质量

1.3.3 单因素及响应面试验设计

设定液料比20：1、提取时间20min、提取功率96W，固定其他条件，分别考察提取时间(10、20、30、40、50min)、提取功率(24、48、72、96、120W)和液料比(5：1、10：1、15：1、20：1、25：1)对香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响。采用超声波辅助法提取半胱氨酸亚砜裂解酶时温度控制在4℃，提取结束后于4℃条件下离心处理。依据单因素试验结果，结合Box-Behnken试验设计原理，采用响应面法分析提取时间、提取功率和液料比对响应值的影响。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助法提取半胱氨酸亚砜裂解酶的单因素试验

2.1.1 提取时间对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响

由图1可知，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率随提取时间的延长不断提高，在提取时间为20min时达到最大。20min之后，随着提取时间的继续延长，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率出现明显的下降趋势。说明延长超声波处理时间可以促进破碎细胞内的半胱氨酸亚砜裂解酶扩散到提取缓冲液中，当超声波处理时间为20min时，细胞内的半胱氨酸亚砜裂解酶已经基本溶出，此时半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率到达最大值。过长的超声波处理时间可能会导致半胱氨酸亚砜裂解酶的酶结构破坏，半胱氨酸亚砜裂解酶的酶活性降低，造成其提取率下降[7]。

图 1 提取时间对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on C-S lyase extraction

2.1.2 提取功率对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响

图 2 提取功率对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on C-S lyase extraction

由图2可知，超声功率由24W增加到96W的过程中，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率显著增大，超声功率达到96W时，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率具有最大值；但随着超声功率继续增大，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率降低。这说明在超声功率小于96W时，超声功率的增强，介质质点运动加速，使半胱氨酸亚砜裂解酶迅速从细胞内游离出并溶解于提取缓冲液中，随着空化作用、均匀化作用的加强，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率达到最大值[13]。超声功率过大会引起体系局部的高温、高压，造成酶结构的破坏[14]，降低半胱氨酸亚砜裂解酶的酶活，降低其提取率。

2.1.3 液料比对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响

由图3可知，随着液料比的增大，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率逐渐上升，液料比增加到15：1时，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率到达最大值；液料比继续增大，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率基本保持不变。这说明一定范围内液料比的增大有利于半胱氨酸亚砜裂解酶从破碎细胞内游离扩散出来，当液料比达到一定值时，细胞内半胱氨酸亚砜裂解酶的溶出量已经达到最大限，此时继续增大液料比，对半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率影响不大。过大的液料比会造成后续分离纯化半胱氨酸亚砜裂解酶时能源和试剂的浪费，不利于实际操作[15]。

图 3 液料比对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on C-S lyase extraction

2.2 超声波辅助法提取半胱氨酸亚砜裂解酶的响应面试验

2.2.1 响应面试验设计

为优化单因素试验得到的工艺条件，以提取时间、提取功率和液料比为因素，采用Box-Benhnk设计试验，因素水平编码、试验方案及结果见表1。

表 1 响应面试验设计及结果Table 1 Experimental trails and results for response surface analysis

2.2.2 因素与提取率模型的建立及显著性检验

应用Design Expert 8.0软件对表2中的数据进行分析，获得自变量与半胱氨酸亚砜裂解酶提取率(Y)的回归方程：Y＝49.0881＋0.6848A＋2.3249B－0.2868C＋0.2169AB＋0.2763AC＋0.7442BC－0.2094A2－7.5598B2－2.0315C2。

由表2可以看出，该回归模型P＜0.0001，回归模型达到极显著，失拟项P＝0.1640＞0.05，不显著；回归模型因变量和自变量之间的关系显著(R2＝0.9944)，说明模型的拟合程度较好，试验误差小。可以利用该方程获得最佳提取工艺条件。分别对该方程各自变量(A、B、C)求极值，得到极值点为A＝0.1627，B＝0.1548，C＝0.0282，即提取时间21.63min、提取功率99.72W、液料比15.14：1(mL/g)。在此最优条件下，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率为49.37U/g。参考实际操作以及超声波仪器功率选择，将优化后的工艺参数调整为提取时间21.5min、提取功率100W、液料比15：1(mL/g)，在此条件下进行3次验证实验，半胱氨酸亚砜裂解酶的平均提取率为48.76U/g，与理论值基本相符，说明回归模型能较好地预测超声波辅助法提取半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率，优化得到的提取条件参数是准确可靠的，具有实际应用价值。采用常规静止浸提法，提取时间为60min，在此条件下进行3次验证实验，半胱氨酸亚砜裂解酶的平均提取率为26.21U/g。结果表明通过响应面优化得到的工艺参数具有实际应用价值，半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率提高了86.04%。

表 2 回归方程的方差分析Table 2 Analysis of variance for the developed regression equation

由表2可知，超声波辅助法提取香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的工艺参数中，影响提取率的各因素的主效应关系为提取功率＞提取时间＞液料比，其中提取功率(B)和提取时间(A)达到极显著水平，液料比(C)没有显著性。

2.2.3 交互作用分析

响应面图能比较直观的反映各因素之间的交互作用，通过多元回归方程做响应面图，超声波辅助法提取香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶工艺中提取时间、提取功率和液料比之间的交互作用对提取率的影响如图4所示。

由图4a可知，提取功率的等高线比提取时间的等高线排列密集，表明提取功率的主效应大于提取时间，提取时间的抛物线坡度趋于平缓，对响应值的影响不大，交互作用不显著。考虑到提取时间过长会造成半胱氨酸亚砜裂解酶酶活下降，可以将提取时间控制在20min左右。

由图4b可知，提取时间和液料比的响应曲面坡度相对平缓，等高线排列疏松且趋向于圆形，表明提取时间和液料比的交互作用不显著，这与统计结果相一致(PAC＝0.3275＞0.05)。由于液料比对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率影响不大，过大的液料比不利于下一步对半胱氨酸亚砜裂解酶进行分离纯化，因此，可以选择较低的液料比进行提取。

图 4 两因素交互作用对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响Fig.4 Response surface of the effect of two factors on C-S lyase extraction

由图4c可知，提取功率和液料比的响应面坡度陡峭，等高线排列紧密且趋向于椭圆，表明提取功率与液料比的交互作用显著[16]。液料比在较低水平时，提取功率的响应抛物线的最高点也在较低水平，此时，提取功率对半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率的影响不明显；随着液料比的增大，提取功率的响应抛物线的最高点在较高水平，此时提取功率对半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率的影响比较明显。

3 结 论

本实验采用超声波辅助法提取香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶，该方法有利于半胱氨酸亚砜裂解酶从细胞中充分溶出，从而显著提高了香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率，缩短了提取时间。该方法可以快速、高效地提取出香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶，为进一步分离纯化该酶并研究其酶学性质和酶分子结构提供了条件，为通过酶分子进化工程手段调控香菇内源型甲醛提供理论依据。

为进一步优化超声波辅助法提取香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的工艺，本实验考察了提取时间、提取功率和液料比3个因素对半胱氨酸亚砜裂解酶提取率的影响，通过单因素试验和响应面试验设计得出各因素对提取率的影响从大小依次为提取功率＞提取时间＞液料比。最终确定提取工艺条件为提取时间21.5min、提取功率100W、液料比15：1(mL/g)，在此最佳工艺条件下，香菇中半胱氨酸亚砜裂解酶的提取率为48.76U/g，比常规静止浸提法提高了86.04%。

[1] YASUMOTO K, IMAIDA K, MITSUDA H. A new sulfur-containing peptide from Lentinus edode acting as a precursor for lenthionine[J]. Agric Biol Chem, 1971, 35(13)： 2059-2069.

[2] YASUMOTO K, IMAIDA K, MITSUDA H. Enzyme-catalized evolution of lenthionine from lentinic acid[J]. Agric Biol Chem, 1971, 35(13)： 2070-2080.

[3] YASUMOTO K, IMAIDA K, MITSUDA H. Enzymatic cleavage of cysteine sulfoxide in Lentinus edodes[J]. Agric Biol Chem, 1975, 39(10)： 1947-1955.

[4] YASUMOTO K, IMAIDA K, MITSUDA H. Enzymatic formation of shii-take aroma from non-volatile Preeursor(s)-lenthionine from lentinicacid[J]. Mushroom Seienee, 1976, 9(1)： 371-383.

[5] FUJIMOTO K, TSURUMI T, WATARI M, et al. The mechanism of formaldehyde formation in shiitake mushroom[J]. Mushroom Science, 1976, 9(1)： 385-390.

[6] IWAMI K, YASUMOTO K. Alliinase-like enzymes in fruiting bodies of Lentinus edodes： their purification and substrate specificity[J]. Agric Biol Chem, 1980, 44(12)： 3003-3004.

[7] 励建荣, 尹洁, 朱军莉, 等. 响应面分析法优化香菇中γ-谷氨酰转肽酶的超声辅助提取条件[J]. 食品科学, 2010, 31(20)： 20-23.

[8] NABARLATZ D, VONDRYSOVA J, JENICEL P, et al. Hydrolytic enzymes in activated sludge： extraction of protease and lipase by stirring and ultrasonication[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2010, 17(5)： 923-931.

[9] 张富新, 陈锦屏, 李林强. 利用超声处理提取皱胃酶的试验研究[J]. 农业工程学报, 2004, 20(3)： 153-156.

[10] 吴燕燕, 王剑河, 李来好, 等. 罗非鱼内脏蛋白酶超声波提取工艺的研究[J]. 食品科学, 2007, 28(7)： 245-248.

[11] 王俊杰, 饶志明, 沈微. 超声波萃取烟叶中3-磷酸甘油脱氢酶的研究[J]. 中国生物工程杂志, 2008, 28(8)： 74-77.

[12] YASUMOTO K, IWAMI K. S-substituted L-cysteine sulfoxide lyase from shiitake mushroom[J]. Methods in Enzymology, 1987, 143： 434-439.

[13] 于修烛, 王玲, 杜双奎, 等. 响应面法优化枳椇子总黄酮超声波提取工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(12)： 125-129.

[14] 肖桂平. 木瓜蛋白酶超声法提取工艺及其酶学性质[J]. 福建农林大学学报, 2005, 34(3)： 318-323.

[15] 贺寅, 王强, 钟葵. 响应面优化酶法提取龙眼多糖工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(2)： 79-83.

[16] 刘奉强, 肖鉴谋, 刘太泽. 应用响应面法优化超声波提取荆芥中总黄酮的工艺[J]. 南昌大学学报, 2011, 33(2)： 149-155.