黄连解毒汤全方与“组合-配伍”提取的比较研究

朱华旭， 潘林梅， 李 欢， 唐于平

(1.南京中医药大学中药复方分离工程重点实验室江苏省方剂研究重点实验室，江苏南京210029)

中药(含复方，下同)由植物、动物和矿物等天然产物构成，其药效物质的获取，不可避免的需要“去伪存真，去粗取精”，因而“分离”是中医药领域的共性关键技术［1］。中药提取分离也是中成药生产过程中最关键的环节，制药工艺、技术的不同能引起成分组合的变化，成分组合的变化可以导致药效的显著变化，它直接影响到产品的质量和临床疗效［2］。

黄连解毒汤源于《外台秘要》，由黄连、黄柏、黄芩、栀子组成，具有清热、泻火、解毒的功效［3］。黄连解毒汤的传统服用方法是汤剂入药。上世纪90年代，日本学者在应用黄连解毒汤治疗脑中风的研究中发现，黄连解毒汤提取物用于脑中风后遗症和脑血管性痴呆症，其效优于苯噻嗪酸钙而无任何副作用;该提取物(エキス)是一种日本汉方制剂，制备方法是利用现代生产技术，模拟传统的中药煎煮方法，将中药的煎取成分制成固体剂型;这一成果得到日本医学界的确认［4］。近年来，我国学者对其改善脑缺血、益智作用的有效部位进行了探索性的研究，研究表明，该方治疗脑部疾病的有效部位为复方中的水溶性成分，包括小檗碱、黄芩苷和栀子苷等［5］。基于上述研究成果，本论文对全方水提取最优工艺进行探讨，并对君臣药组合、君佐药组合、君使药组合、君臣佐药组合、君佐使药组合水提取工艺中指标性成分进行检测，旨在通过阐明复方配伍对君药中指标性成分的影响，建立可体现该方治疗特点的工业化生产工艺，为该方的新药创制提供实验依据。

1 仪器与材料

Agilent 1100液相色谱(Agilent 1100四元泵;DAD检测器;自动进样器;Agilent 1100 LC色谱工作站)，江苏汉邦科技有限公司生产Kromasil C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，Shimadzu Libror AEL－40SM电子天平。

药材均购自南京市药材公司，经本校生药教研室王春根教授鉴定。黄连、黄芩、黄柏、栀子批号分别为050926、051015、050926、041106。对照品均购自中国药品与生物制品检定所，小檗碱批号为110713－200208(供含量测定用)，巴马汀批号为0732－200005(供含量测定用)，药根碱批号为0733－200005(供含量测定用)，黄芩苷批号为 110715－200212(供含量测定用)，栀子苷批号为110749－200511(供含量测定用)。乙腈、甲醇均为色谱纯(江苏汉邦公司)，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 黄连解毒汤全方水提取工艺的研究

黄连、黄柏、黄芩、栀子全方药材按6∶4∶4∶6比例取9份，每份200 g，采用L9(34)正交试验法，分别以加水量(12倍、15 倍、18 倍)、提取时间(2 h、3 h、4 h)、提取次数(1 次、2次、3次)为正交因素，确定复方最佳水提工艺条件。测定各指标性成分生物碱(小檗碱、巴马汀、药根碱)、黄酮苷、栀子苷的转移率，确定全方提取物中各指标性成分的含量。

2.2 黄连解毒汤组方－配伍水提取工艺的研究

根据数学组合原理，君药黄连与臣、佐、使三味药组成5个组合，分别为:黄连+黄芩(君臣药组合)、黄连+黄柏(君佐药组合)、黄连+栀子(君使药组合)、黄连+黄柏+黄芩(君臣佐药组合)、黄连+黄柏+栀子(君佐使药组合)，药材按原方比例取样200 g，以全方的最佳水煎煮工艺提取各组药物组合，测定各指标性成分生物碱(小檗碱、巴马汀、药根碱)和黄酮苷或栀子苷的转移率，比较不同组合中各指标性成分的含量。

2.3 各指标性成分的检测方法

采用HPLC色谱法检测各指标性成分的含量。色谱条件:柱温30℃;流速1.0 mL/min;检测波长238 nm、265 nm、280 nm;流动相为梯度洗脱［6］，A相为乙腈，B相为0.5%三乙胺(磷酸调pH3.1)，梯度为0～20 min 5%A～15%A，20～40 min 15%A～20%A，40～50 min 20%A ～30%A，50～55 min 30%A～5%A。色谱图见图1～3。

图1 生物碱HPLC图谱

图2 栀子苷HPLC图谱

图3 黄芩苷HPLC图谱

2.4 样品溶液的制备

取各组号煎煮液100 mL，干燥至衡重，测定固含量。取各组上述已测定固含的干燥物各0.1 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，加35 mL的50%ACN，超声30 min(功率250 W，频率50 Hz)，放冷至室温，加50%ACN定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得［7］。

2.5 药材样品制备与含量测定

按照2005年版《中国药典》进行样品制备与含量测定［8］。

3 结果

3.1 黄连解毒汤全方水提取最佳工艺

采用L9(34)正交试验法，进行了9次试验，见表1。以生物碱(小檗碱、巴马汀、药根碱三者之和的平均值)、黄酮苷、栀子苷转移率进行考察，确定提取的最佳工艺。

表1 正交设计表

按照2.4项法制备正交实验所对应的各样品溶液1～9，按照2.3项检测样品1～9中上述5种指标性成分的含量，计算各成分相对药材的转移率，结果见表2、3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

由表3的方差分析表可以看出，三因素对水煎煮工艺均无显著性影响;由表2的简单计算可以看出，K3a＞K2a＞K1a，故因素A选择水平3，即加18倍量;K3b＞K2b＞K1b，且K2b与K1b差值远大于K3b与K2b差值，原则上可选择水平2～3之间的任一点，但从节约能源的角度考虑，因素B选择水平2，即煎煮3 h;K2c＞K3c＞K1c，故因素C选择水平2，即煎煮两次。综上所述，确定黄连解毒汤全方水煎煮的最佳提取工艺为A3B2C2，即加18倍量水煎煮2次，第1次10倍量水、第2次8倍量水，每次1.5 h。

3.2 黄连解毒汤全方水提取最佳工艺验证

黄连、黄柏、黄芩、栀子全方药材按6∶4∶4∶6比例取3份，每份200 g，按照上述最优工艺条件提取，提取液分别测定平均转移率。见表4。

表4 最佳工艺条件验证

由表4可知，按正交试验优选的最佳工艺进行试验，平均转移率大于50%，有效成分提取较完全。

3.3 黄连解毒汤组方－配伍水提取工艺

组方－配伍五组为黄连 +黄芩、黄连 +黄柏、黄连 +栀子、黄连+黄柏+黄芩、黄连+黄柏+栀子，以黄芩+栀子、全方两组为对照，分别以18倍量水煎煮提取各组药物组合，第1次10倍量水、第2次8倍量水，每次1.5 h。煎煮后各样品按照2.4项法制备样品溶液1′～7′，按照2.3项检测样品1′～7′中上述5种指标性成分的含量，计算各成分相对药材的转移率，结果见表5。

表5 组方-配伍试验结果(n=3)

4 讨论

4.1 由于黄连解毒汤各药配伍的复杂性和不稳定性，在传统煎煮过程中，黄连中的季铵碱与黄芩中的黄芩苷发生反应而产生大量沉淀;药味不同配伍煎煮对黄连中小檗碱的溶出率亦有显著性影响，黄连与黄柏配伍，生物碱含量增高，但其溶出率不等于两药材中小檗碱含量的简单加和;黄连与黄芩、黄连与栀子配伍，小檗碱溶出率均较单味黄连水煎液降低;全方煎煮时，小檗碱溶出率则是各味药材协同作用的结果［3］。因此在全方及不同组合的水溶液环境中各指标性成分的含量和相互影响的研究基础上，通过建立全方及不同组合中各指标性成分体外浓度与体内吸收、分布的相关性，对于阐明复方量效关系的具有实质性意义。

4.2 本论文通过正交试验确立了全方水煎煮的最佳工艺，以期在水煎煮工艺操作中，获得稳定的、可再现的全方提取物，为后续的体内药物动力学研究奠定了基础。在确立水煎煮最佳工艺后，我们分别考察不同组合对黄连中生物碱转移率的影响。研究发现，在复方水溶液体系中，栀子苷的含量基本保持稳定，生物碱转移率受到黄芩苷的影响较大，但全方共煎的转移率仍较黄连黄柏配伍组合高，因此，能否从化学成分的角度印证传统汤剂组方的合理性，值得进一步商榷。

4.3 中药间合理的配伍是中药复方的核心，也是复方不同于单味药的主要奥妙所在。古人说“药有个性之特长，方有合群之妙用”。中药复方多以汤剂入药，传统汤剂是在中医药理论指导下，按君臣佐使的组方原则配伍的有机组合，深入地对各药味进行化学成分研究，探讨药味各组分在疗效中所起的作用和组方配伍原则，进而阐明汤剂的物质基础和作用机理，是创立和研制新方的重要依据。

［1］郭立玮，潘林梅，朱华旭.中药提取物伴生物质的生物药剂学特性及其制剂学意义［J］. 中草药，2007，38(9):1281－1286.

［2］曹春林主编.中药药剂学［M］.上海:上海科学技术出版社，1990:559－575.

［3］陈光亮，张秀荣，王钦茂.黄连解毒汤的化学及药理学研究进展［J］. 中草药，2008，39(6):935－938.

［4］李华安.黄连解毒汤的研究及应用［J］.山东中医学院学报，1995，19(5):312.

［5］张艺平，韩 鹏.黄连解毒汤治疗脑病的药理与临床研究新进展［J］. 中华实用中西医杂志，2003，16(12):1832－1834.

［6］任玲玲，薛兴亚.黄连解毒汤高效液相色谱分析方法的建立［J］. 世界科学技术－中医药现代化，2005，7(5):41－44.

［7］沈 嘉，赵建平.黄连解毒汤质量考察［J］.中成药，1999，21(10):502－504.

［8］中国药典［S］.2005:173，211－212，214－215.