珍珠舌草胶囊挥发油对胃癌细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

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(1.山西省中医院，山西 太原 030001；2.山西医科大学第二医院，山西 太原 030013)

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，全球每年新确诊病例约93.4万人，位居所有恶性肿瘤的第二位[1]。慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)伴癌前病变则大大增加胃癌的发病率，因此延缓和阻止甚至逆转癌前病变的病理性进程能够有效预防胃癌的发生。

目前西医缺乏治疗慢性萎缩性胃炎伴癌前病变(肠化生和异型增生)的有效方法，治疗多以缓解症状为主，还没有行之有效的阻断和逆转该病的西药。中医药治疗胃癌前病变具有一定的优势[2]。本课题组2007～2012年先后两次运用珍珠舌草胶囊对CAG伴癌前病变进行临床研究[3,4]，经临床反复验证，发现其在改善慢性萎缩性胃炎临床症状，降低胃黏膜慢性炎症、Hp感染等方面作用显著。甚至还可以逆转肠化生和异型增生。

珍珠舌草胶囊全方中枳实、莪术和蒲公英等富含挥发油[5-7]。研究证实，多种挥发油具有抗肿瘤作用[6,7]，本研究旨在观察珍珠舌草胶囊全方挥发油对AGS细胞增殖和凋亡的作用并对其机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

AGS细胞株购于中国科学院细胞库；Ham’s/F-12 培养液购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；胎牛血清(FBS)购于杭州四季青生物工程有限公司；DMSO(二甲基亚枫)和RNase A(核糖核酸酶A)购于金科宏达生物公司；MTT购于上海日初生物科技有限公司；PI(Propidium iodide,碘化丙啶)购于美国Sigma公司；胰酶购于美国Invitrogen公司；33342/PI 试剂盒购于中国Beyotime公司；Annexin V购于美国BioVision公司；各种规格培养板购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；SpectraMAX 190 微孔读板机购于美国分子仪器公司(MD，USA)；FACScan 流式细胞仪购于美国BD公司(Becton Dickinson，USA)；ModFitLT V3.0软件和荧光显微镜购于日本Olympus公司。

1.2 原药材

珍珠舌草胶囊中黄芪、枳实、白术、木香、砂仁、丹参、莪术、珍珠层粉、蒲公英、白花蛇舌草等药材购于山西国新晋药集团有限公司。

1.3 珍珠舌草胶囊全方挥发油的提取

依据2010版中国药典附录VD挥发油测定法甲法提取，首先将珍珠舌草胶囊方一帖粉碎成粗粉转移至1 000 mL原底烧瓶，加入8倍量水浸泡 5 h左右，加入沸石，连接挥发油提取器，检查气密性后武火煮沸，改成文火保持微沸约8h至不再有挥发油提出后，停止加热，放置片刻，开启测定器下端活塞，将水缓缓放出，至油层上端达到刻度0线上面5 mm处为止，放置1 h以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，存放于密闭棕色玻璃瓶中待用。

1.4 细胞培养

AGS细胞培养于含10%FBS的Ham’s/F 12 培养液，置于37°C、5 % CO2的细胞培养箱中培养。

1.5 细胞活力的检测

细胞存活率检测 AGS细胞接种于96孔板内，接种密度为1.0×104个细胞/mL，每孔接种200 μL，使其贴壁过夜。采用信封法分组，给予不同浓度(0、40、80、160μg/mL)的珍珠舌草胶囊挥发油干预AGS细胞的生长(n≥6)，孵育12 h和24 h后，加入20 μL的MTT，接着孵育4 h，弃培养基和MTT，加入150 μL的DMSO(二甲基亚砜，dimethy sufoxide)，振荡混匀15 min，570 nm处OD值用SpectraMAX 190微孔读板机检测，生长抑制率按[1-(用药组OD值 /未用药组OD值) ]× 100 %计算。

1.6 细胞周期的检测

AGS细胞以2×104个/mL浓度接种在6孔培养板中，过夜待细胞贴壁后，将培养液换成不含血清的培养基，饥饿以同步，继续培养24 h后，换上含有药物和不含药物的新鲜培养基，含药物浓度为40、80、160μg/mL,细胞孵育12、24 h，按细胞周期检测步骤进行实验。作用时间到达后用0.25%的胰酶消化细胞，用冷PBS终止消化，吹打细胞，移入离心管中。弃上清，冷PBS洗两次。离心去PBS，加入1mL PBS重悬细胞，吹入冰预冷的无水乙醇固定，4℃，6h以上。1 000 rpm离心5 min弃去固定液，2 mL冷PBS洗两次，离心后弃上清。4℃用PI染液染色，避光孵育30min。流式细胞仪检测。

1.7 细胞凋亡检测

AGS细胞以2.5×104个/mL密度接种在6孔培养板中，每孔3 mL，贴壁24 h后，将培养液换成不含血清的培养基，饥饿以同步，继续培养24 h后，换上含有药物和不含药物的新鲜培养基，珍珠舌草胶囊挥发油浓度为40、80、160μg/mL，允许细胞生长12、24 h，作用时间到达后从培养箱中取出细胞，收集细胞上清，加0.125%胰酶消化细胞，37 ℃约1 min，加含血清的细胞培养液终止胰酶的作用，轻柔吹打细胞，并收集细胞与上清一起，切忌损伤细胞。冰冷PBS(4 mL)中离心(300 g，5 min)，弃上清，旋涡振荡器点动分散细胞后，加入4 mL Annexin V结合缓冲液再次洗涤细胞一次后完全弃上清。将细胞分散后加入500 μL Annexin V结合缓冲液重悬细胞，随后加入FITC标记的Annexin V 1μL(终浓度1μg/mL)，再次点动混匀，随后冰浴30 min，中间取出再混匀1次。30 min后，加入4 mL Annexin V结合缓冲液洗涤细胞，弃上清后，点动分散细胞，加入500 μL Annexin V结合缓冲液重悬细胞，置于冰浴中保存。上机前加入PI(终浓度5μg/mL)，并立即上机检测。

1.8 Caspase 3活性检测

AGS细胞以2.5×104个/mL密度接种在6孔培养板中，贴壁过夜，换上含有药物和不含药物的新鲜培养基，含有药物培养液浓度40、80μg /mL，允许细胞生长12、24 h，0.25%胰酶消化，细胞数需达到(1～5)×106个，离心1 500 rpm 5 min，悬浮细胞于50μL冰冷细胞裂解液10 min，10 000 g离心1 min，收集上清，冰上放置，然后进行蛋白浓度测定，将50～200μg蛋白用细胞裂解液补充至50 μL，加入50μL的2×反应缓冲液(含10 mM DTT)，加入5 μL的4 mM的DEVD-pNA(200μM终浓度)，37 °C孵育1～2 h，在酶标仪405 nm处测定吸光值(OD)。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 珍珠舌草胶囊全方挥发油对胃癌细胞活力的影响

40～160μg /mL的全方挥发油干预细胞12 h，可使AGS细胞活力从92.40%下降到19.60%；干预细胞24 h，可使AGS细胞活力从72.60%下降到6.10%，呈良好的浓度和时间依赖性。见表1(12 h组间比较，F=2 549.15；24 h组间比较，F=8 189.36，P<0.05)。

表1 珍珠舌草胶囊全方挥发油对AGS细胞活力的影响 %

注：1)与同组比较，P<0.05

2.2 珍珠舌草胶囊全方挥发油对细胞周期的影响

珍珠舌草胶囊全方挥发油干预胃癌细胞12 h能阻滞细胞于G2/M期，提示其能抑制胃癌细胞的分裂，从而阻止胃癌细胞的增殖，12 h从17.47%上升至32.53%，表明珍珠舌草胶囊全方挥发油干预胃癌细胞AGS细胞能阻滞胃癌细胞周期于G2/M期。见图1(组间比较，F=182.57，P<0.05)。

图1 珍珠舌草胶囊全方挥发油对胃癌细胞周期的影响(12 h)Figure1 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Cell Cycle ofGastric Cancer(12 h)

图1A Control组细胞周期图示
图1B 珍珠舌草胶囊全方挥发油40μg /mL组细胞周期图示
图1C 珍珠舌草胶囊全方挥发油80μg /mL组细胞周期图示
图1D 珍珠舌草胶囊全方挥发油160μg /mL组细胞周期图示
图1E 珍珠舌草胶囊全方挥发油对细胞周期的影响

珍珠舌草胶囊全方挥发油干预胃癌细胞24 h能阻滞细胞于G2/M期，从19.07%上升至38.79%，表明珍珠舌草胶囊全方挥发油干预胃癌AGS细胞能阻滞胃癌细胞周期于G2/M期。见图2(组间比较，F=705.68，P<0.05)。

2.3 珍珠舌草胶囊全方挥发油对细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果表明，珍珠舌草胶囊全方挥发油0 μg/mL、40 μg/mL、80μg/mL、160μg/mL干预胃癌细胞12 h后，早期凋亡率分别为5.30%、10.50%、13.60%、17.60%，见图3(组间比较，F=242.8，*P<0.05, **P<0.01)。干预24 h后，早期凋亡率分别为7.60%、11.30%、18.20%、25.00%，见图4(组间比较，F=3 050.53，*P<0.05, **P<0.01)，具有时间和浓度的依赖性。

2.4 珍珠舌草胶囊全方挥发油对Caspase 3活性检测的影响

珍珠舌草胶囊全方挥发油干预AGS细胞12 h，40μg /mL组和80μg /mL组Caspase 3的活性分别是对照组的1.90倍和4.31倍，见表2(组间比较，F=282 807.00，P<0.05)。干预24 h后，则是对照组的3.19倍和8.74倍，见表2(组间比较，F=15 081 762.2，P<0.05)。提示全方挥发油能呈时间和浓度依赖性地增加Caspase 3的活性，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2 珍珠舌草胶囊全方挥发油对胃癌细胞周期的影响(24 h)Figure2 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Cell Cycle ofGastric Cancer(24 h)

图2A Control组细胞周期图示
图2B 珍珠舌草胶囊全方挥发油40μg /mL组细胞周期图示
图2C 珍珠舌草胶囊全方挥发油80μg /mL组细胞周期图示
图2D 珍珠舌草胶囊全方挥发油160μg /mL组细胞周期图示
图2E 珍珠舌草胶囊全方挥发油对细胞周期的影响

图3 珍珠舌草胶囊全方挥发油对胃癌细胞凋亡的影响(12 h)Figure3 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Apoptosis ofGastric Cancer Cells(12 h)

图3A Control组细胞凋亡图示
图3B 珍珠舌草胶囊全方挥发油40μg /mL组细胞凋亡图示
图3C 珍珠舌草胶囊全方挥发油80μg /mL组细胞凋亡图示
图3D 珍珠舌草胶囊全方挥发油160μg /mL组细胞凋亡图示
图3E 珍珠舌草胶囊全方挥发油对细胞凋亡的影响

图4 珍珠舌草胶囊全方挥发油对胃癌细胞凋亡的影响(24 h)Figure4 Effects of ZZSCB Volatile Oil on the Apoptosis ofGastric Cancer Cells(24 h)

表2 珍珠舌草胶囊挥发油对Caspase3活性的影响 %

3 讨论

珍珠舌草胶囊由黄芪、枳实、白术、木香、砂仁、丹参、莪术、珍珠层粉、蒲公英、白花蛇舌草等组成。本研究通过体外实验结果显示珍珠舌草胶囊全方挥发油能很好地抑制胃癌AGS细胞生长，阻滞细胞于G2/M期，诱导细胞凋亡。细胞增殖与凋亡的平衡对于保持胃肠黏膜的完整性具有重要意义[8，9]。一旦这种平衡被破坏，就会诱发慢性萎缩性胃炎或胃癌前病变甚至是肿瘤的发生[9，10]。肠化生和异型增生打破了正常胃黏膜细胞增殖与凋亡的平衡，增加了胃癌发生的机率，周期阻滞和诱导凋亡是抑制细胞生长的两个重要的因素。本研究证实珍珠舌草胶囊全方挥发油能显著抑制AGS细胞的生长，可能与其阻滞细胞于G2/M期并促进AGS凋亡有关。Caspase 3是这两条途径的一个主要环节，珍珠舌草胶囊全方挥发油能显著增强Caspase 3的活性，其干预AGS细胞12 h，40 μg /mL组和80 μg /mL组Caspase 3的活性分别是对照组的1.90倍和4.31倍，干预18 h后，则是对照组的3.19倍和8.74倍。提示全方挥发油能呈时间和浓度依赖性地增加Caspase 3的活性。珍珠舌草胶囊全方挥发油能显著促进AGS细胞凋亡，可能与其增强Caspase 3的活性有关。

研究表明，白术中含有苍术醇、苍术酮、萜烯类化合物具有抑菌、抗肿瘤的作用[6]，枳实中柠檬烯具有抗炎作用[5]，莪术中的莪术油也具有抗肿瘤的作用[6]，蒲公英和白花蛇舌草都含有亚麻酸，具有抗炎[7]、抗肿瘤[11]的作用，黄芪中黄酮类具有显著的增强机体免疫力的作用[12]，木香中萜类具有抗炎、抗肿瘤和抗溃疡的作用[13]。砂仁中挥发油具有抗炎、镇痛和止泻的功效[14]，丹参中桃拓酚具有很强的抑菌以及抗氧化作用[15]。珍珠舌草胶囊全方挥发油中许多有效成分具有抗炎、抗溃疡、抑菌、调节胃肠道微循环、抗肿瘤和增强机体免疫力的作用。这可能是珍珠舌草胶囊治疗CAG伴癌前病变甚至是消化系统肿瘤的有效成分。

综上所述，珍珠舌草胶囊全方挥发油具有较好的抑制细胞生长的作用，此作用可能与其阻滞细胞周期、促进细胞凋亡有关，促凋亡作用可能通过Caspase 3的活性增强实现，该结果为珍珠舌草胶囊抗肿瘤研究提供了实验依据。