DNA甲基转移酶在胃癌和癌前病变中的表达及意义 *

叶 振 刘文天

(1.泰山医学院附属泰山医院感染科，山东 泰安 271000； 2.天津医科大学总医院消化科，天津 300052)

胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，死亡率非常高，严重危害着人们的身体健康。分子生物学研究表明，胃癌是许多癌基因、抑癌基因经过多阶段、多途径协同作用，逐步发展形成的。DNA 甲基化是调节癌基因和抑癌基因的表达的重要机制。而DNA甲基转移酶(Dnmts)具有调控DNA甲基化的作用，因此，对DNA甲基转移酶的研究将为胃癌的早期诊断、治疗和预后提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象：

通过手术及内镜活检取67例病例标本，依据病理检查结果，分为三组：胃癌组26例；胃癌前病变组(萎缩性胃炎伴肠化及不典型增生)20 例;正常对照组21例。应用免疫组织化学SP法检测组织中Dnmt3A和Dnmt3B的表达水平。

1.2 主要免疫组化试剂：

I抗:兔抗人Dnmt3A和Dnmt3B单克隆抗体上海百奇生物制品有限公司 II抗:兔抗人免疫组化二抗试剂盒天津灏洋生物技术公司兔抗幽门螺旋杆菌多克隆抗体北京中杉生物技术公司

1.3 标本处理：

1.3.1标本采集：

21例胃癌外科手术标本，胃癌组织取自无坏死的肿瘤组织，切取约1 cm3大小的组织块。5例胃癌以及20例癌前组织和25例正常组织胃镜活检标本，于检查过程中取材。

1.3.2组织切片制备：

标本经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。

1.4 免疫组化：

烤片、脱蜡、水化、阻断、灭活内源性过氧化物酶、抗原修复、滴加抗体、PBS冲洗、显色、冲洗、复染、脱水、透明、封片。

1.5 镜检、统计阳性表达率:

光镜下观察切片，每张切片随机选择5个高倍视野(20×20)记数阳性细胞百分率，再根据阳性细胞的数目，将Dnmt3A和Dnmt3B阳性细胞分级。Dnmt3A和Dnmt3B阳性表达为胞浆呈棕黄色，亦可见胞核着色,标准定级为: 阳性细胞着色数0%～5%为(-)，阳性细胞数6%～25%为(+-)，阳性细胞数26%～50%为(+)，阳性细胞数51%～75%为(++),阳性细胞数>76%为(+++),以(-)定为Ⅰ级，(+-)定为Ⅱ级，(+)定为Ⅲ级，(++)定为Ⅳ级，(+++)定为Ⅴ级。

1.6 实验结果的统计学处理:

采用SPSS15.0软件，进行χ2检验、四格表确切概率法(Fisher’s Exact Test检验及秩和检验(Wilcoxon Signed Ranks Test)P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 Dnmt3A表达

见表1。表明在胃癌组织中Dnmt3A表达的阳性率与癌前组织和正常组织中Dnmt3A表达的阳性率相比具有显著差异性(P<0.05)。在胃癌组织中Dnmt3A表达强度与癌前组织和正常组织中Dnmt3A表达强度相比不具有显著差异(P>0.05)。表明，在胃癌组织中Dnmt3A表达的阳性率高于癌前组织和正常组织。

表1 胃癌组、癌前组和正常组织组中Dnmt3A的表达情况

见表2 。在高、中分化组中Dnmt3A表达强度与低、未分化组相比具有显著差异性(Z =-2.385，P〈0.05)。在无淋巴结转移组中Dnmt3A表达强度与存在淋巴结转移组相比不具有显著差异性(Z =--0.061，P>0.05)。浸润深度为T1+T2组中Dnmt3A表达强度与T3+T4组相比不具有显著差异性(Z =--0.929，P>0.05)。表明，在高、中分化组中Dnmt3A表达强度高于低、未分化组；Dnmt3A表达强度与淋巴结转移和浸润深度不具有相关性。

表2 胃癌组织中Dnmt3A的表达强度与临床病理特征的关系

2.2 Dnmt3B表达

见表3。表明在胃癌组织中Dnmt3B表达的阳性率与癌前组织和正常组织中Dnmt3B表达的阳性率相比具有显著差异性(P<0.05)。在胃癌组织中Dnmt3B表达强度与癌前组织和正常组织中Dnmt3B表达强度相比不具有显著差异性(P>0.05)。表明，在胃癌组织中Dnmt3B表达的阳性率高于癌前组织和正常组织。

表3 胃癌组、癌前组和正常组织组中Dnmt3B的表达情况

见表4。在高、中分化组中Dnmt3B表达强度与低、未分化组具有显著差异性U=-2.030，P〈0.05)。在无淋巴结转移组中Dnmt3B表达强度与存在淋巴结转移组相比不具有显著差异性(Z =-0.247，P>0.05)。浸润深度为T1+T2组中Dnmt3B表达强度与T3+T4组相比不具有显著差异性(Z =-0.315，P>0.05)。表明，在高、中分化组中Dnmt3B表达强度高于低、未分化组；Dnmt3B表达强度与淋巴结转移和浸润深度不具有相关性。

表4 胃癌组织中Dnmt3B的表达强度与临床病理特征的关系

Ⅰ级 图1.1 胃癌组Dnmt3A放大比例400倍

Ⅱ级图1.2 胃癌组Dnmt3B放大比例400倍

Ⅲ级图2.1 癌前病变组Dnmt3A放大比例400倍

Ⅳ级图2.2 癌前病变组Dnmt3B放大比例400倍

Ⅴ级图3.1 正常组Dnmt3A放大比例400倍

Ⅴ级图3.2正常组Dnmt3B放大比例400倍

3 讨 论

DNA的甲基化并不改变基因的碱基序列,而是通过影响基因的表达以改变其功能。DNA 异常甲基化分为DNA高甲基化和DNA低甲基化,前者指DNA不发生甲基化的位点被甲基化; 后者指DNA发生甲基化的位点未甲基化。

胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因异常的累积过程。抑癌基因的启动子区高甲基化是肿瘤重要致病因素之一，在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，并且常表现出肿瘤特异性。已有研究表明抑癌基因甲基化在胃黏膜癌变中起重要作用[1，2]。

已知的真核生物DNA甲基转移酶(Dnmt)有三大亚型:DNA甲基转移酶1(Dnmtl)、DNA甲基转移酶2(Dnmt2)和DNA甲基转移酶3(Dnmt3)。Dnmt广泛参与生物的生长发育过程，其作用主要分为两类：维持DNA甲基化作用和更新甲基化作用[3]。Dnmtl主要是一种维持型的甲基转移酶，对于半甲基化状态的DNA链具有较强的活性;Dnmt3主要是一种更新甲基转移酶，对于完全没有甲基化的DNA链具有较强的活性。

根据 Dnmt3家族成员的结构和功能特征，可分为三种亚型，即Dnmt3A、Dnmt3B和Dnmt3L。

Okano等[4]在人和鼠中鉴定了含有高度保留的5-胞嘧啶甲基化酶模序(motifs)的2个同源基因，分别命名为Dnmt3A(人，鼠为Dnmt3a)和Dnmt3B(人，鼠为Dnmt3b)。Dnmt3A的 cDNA长4 192bp，编码908个氨基酸的蛋白质。人的Dnmt3A和Dnmt3B cDNA与鼠基因高度同源。Dnmt3A和Dnmt3B在未分化的胚胎干细胞中表达丰富。Xie等[5]用FISH方法，定位Dnmt3A基因于2号染色体p23。1998年有学者通过EST数据库分析研究鉴定出人的Dnmt3A基因定位于2号染色体p23,并发现人和小鼠Dnmt3 a的氨基酸有96%的同源性[6]。1999年绘制出人类的Dnmt3B基因图,位于20号染色体q11.2,与小鼠有85%的同源性[7]。Dnmt3L是近期新发现的又一Dnmt3家族成员。这个蛋白在哺乳动物的生殖细胞中特异表达。Dnmt 3L与Dnmt3A和Dnmt3B在结构上有一定的相似性。它有半胱氨酸丰富区，但缺少PWWP结构域和ATRX结构域。它没具有催化DNA甲基化的酶活性，却是生殖细胞建立DNA甲基化形式所必需的。因此，推测Dnmt3L可能是一个调节因子。

Ding[8]的研究显示，Dnmt1，Dnmt3A和Dnmt3B在胃癌组织中表达阳性率为81.6%,81.6%和68.4%,明显高于癌旁组织39.5%, 50%, 44.7%和正常组织10.5%, 10.5%, 7.9%。因此Dnmt的过度表达参与了肿瘤的形成，但Dnmt和组织生物学行为没有相关性。我们的研究显示，胃癌组Dnmt3A表达的阳性率是96.2%，胃癌前病变组是65.0%，正常对照组是76.2% 。在胃癌组织中Dnmt3B表达的阳性率96.2%，胃癌前病变组是55.0%，正常对照组是81.0%。以及通过与临床、病理参数的关系的讨论可知：1.胃癌组织中Dnmt3A、Dnmt3B高表达。Dnmt3A、Dnmt3B可能通过促进DNA甲基化，抑制相关基因的表达，在胃癌发生发展的过程中，Dnmt3A、Dnmt3B可能参与胃癌的分化过程。2.检测胃黏膜组织Dnmt3A、Dnmt3B可能是一种有用的肿瘤标志物。3.Dnmt3A、Dnmt3B的表达不参与胃癌的进展。

[1] Choi IS,Wu TT.Epigenefic alterations in gastric carcinogenesis [J].Cell Res,2005,15(4):247-254

[2] Tamura G.Promoter methylation status of tumor suppressor and tumor-related genes in neoplastic and non-neoplastic gastric epithelia[J].Histol Histopathol,2004,19(1):221-228.

[3] Yuzuru K, Masahiro K, Kenichiro H,et.Role of the Dnmt3B family in de novo methylation of imprinted and repetitive sequences during male germ cell development in the mouse.Human Molecular Genetics .2007，16(19):2272-2280.

[4] Okano M, Xie S P, Li E. Nature Genet, 1998; 19(3):219- 220 .

[5] Xie P,Wang J,O kano,et al. Gene.1999,23, 6(1): 87-95.

[6] Gaudetf,Talbotd,Leonhardth,etal.A short DNA methyltransferase isform restores methylation in vivo[J]. JBiolChem, 1998, 273 (49): 32725- 32729.

[7] Robertson Kd,Uzvolgyie,Liang G,et al.The human DNA methyltransferases (DNMTs)1,3a And 3b:coordinate mRNA expression in normal tissues And overexpression in tumors[J].Nucleic Acids Res. 1999, 27:2291-2298.

[8] Ding Wen-Jin，Fang Jing-Yuan，Chen Xiao-Yu，et cetera.Methyltransferase Proteins in Human Gastric Cancer.Dig Dis Sci 2008,53:2083-2089.