吡格列酮抑制体外高糖培养乳鼠心肌细胞凋亡作用的研究*

张焕峰 赵洪友

(山东省煤炭泰山疗养院，山东 泰安 271000)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者的一个严重并发症。心肌细胞有不可再生的特点，且心肌细胞凋亡可能是导致糖尿病心肌细胞丢失及心力衰竭的重要原因之一[1]。糖尿病时通过抑制心肌细胞凋亡是防止DCM发生的重要途径之一。吡格列酮(pioglitazone, PGZ)噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，对2型糖尿病有较好的降糖效果和耐受性，可使空腹血糖(FPG)和糖化血红蛋白(HbA1c)显著下降；同时可使血胰岛素和C肽水平降低，也可使餐后血糖和胰岛素水平下降；其对血糖控制的改善作用较持久。同时又是PGZ又是过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxi-some proliferators-activated receptors-γ, PPAR-γ)激动剂。研究发现PPAR-γ在心脏和心肌均有表达[2]，且在多种心脏疾病的发生发展中起到重要作用。本实验拟在体外模拟糖尿病时体内高血糖环境，并研究PGZ对高糖环境的心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1实验动物

Wistar乳鼠，出生2～3 d，雌雄不限，由山东大学实验动物中心提供。

1.1.2主要实验试剂及仪器

DMEM培养基(Sigma公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)，倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)，流式细胞仪(BD FACS Calibur USA)，二氧化碳孵箱(CO2 INCUBATOR SANYO ELECTRIC CO. LTD.)，吡格列酮原粉剂(北京太阳药业)。

1.2 实验方法

1.2.1乳鼠心肌细胞的培养

在无菌的条件下，取出生2～3d的Wistar乳鼠，颈椎脱臼法处死，酒精消毒，开胸取出心脏。用D-Hanks洗涤三次，眼科剪成约1mm3大小的碎片，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞5 min。收集细胞后，接种于含10%小牛血清的DMEM培养基25cm2培养瓶并置于CO2孵箱常规培养致75%融合。

1.2.2实验分组及给药方法

将上述细胞转移到两个24孔板上，随机分为3组，每组16孔，换培养基的同时给药，每组给药如下，正常对照组：正常培养心肌细胞，不加入葡萄糖；葡萄糖浓度为25mmol/L组；葡萄糖浓度为25mmol/L组+PGZ 10μmol/L组。给药48h后，分别测定以下指标。

1.2.3乳酸脱氢酶(LDH)含量的测定取培养后心肌细胞的上清液，经全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶活力，作为判断心肌细胞损伤程度的指标。

1.2.4四唑盐比色法测定心肌细胞生长及增殖活性各组细胞

于测试前4 h，每孔加入2 mg/mL的MTT液(50μl/孔)；于CO2孵育箱中继续培养4h后弃去培养液，每孔加入DMSO 0.15 mL，充分振荡10 min后使结晶充分溶解，上酶标仪检测570 nm波长处各孔的吸光度值(OD值)。

1.2.5流式细胞仪检测培养心肌细胞的凋亡率

将心肌细胞培养48h后，不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗涤细胞二次(离心2000rpm，5min)收集1～5×105细胞；入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL PI，混匀；室温、避光、反应5～15min在1 h内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组培养液上清LDH含量及四唑盐比色法结果

高糖环境中，培养液上清LDH含量明显增高，心肌细胞存活率明显下降，而经过PGZ干预后，LDH含量下降，心肌细胞存活率明显增高，各组之间比较具有显著性差异(P<0.01)。见表1。

表1 各组培养液上清LDH含量及心肌细胞存活率

*与空白对照组相比，P<0.01;与Glu组相比P<0.01。

2.2 细胞凋亡检测结果

以正常对照组设门，Glu组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和坏死率分别为19.11%(LR)、11.23%(UR)、0.07%(UL)；而PGZ组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和坏死率分别为33.13%(LR)、12.65%(UR)、0.11%(UL)。见图1、2、3。

图1 空白对照组

图2 Glu组细胞凋亡率

图3 PGZ组细胞凋亡率

3 讨 论

心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的重要机制之一。本研究显示，体外培养的高糖干预下的培养液上清中LDH含量增高，心肌细胞存活率降低，凋亡的心肌细胞明显增多。吡格列酮(pioglitazone，PGZ)对体外高糖环境下心肌细胞培养的干预后，LDH含量显著下降；心肌细胞存活率显著升高、心肌凋亡细胞明显减少。说明PGZ能在体外高糖环境下抑制乳鼠心肌细胞凋亡的作用。进而提示PGZ对体外高糖培养的乳鼠心肌细胞具有保护作用。

噻唑烷二酮类药物有抑制细胞凋亡、增殖的作用[3]。PGZ是其代表性药物，它是一种新型的胰岛素增效剂，通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxisome proliferators activated recep-tor-γ，PPAR-γ)而显著改善2型糖尿病患者的胰岛素抵抗，高胰岛素、高脂血症、高血糖症而广泛应用于临床。但其保护心肌细胞的作用可能存在其他机制：在体外实验中已证明PGZ可以通过降低内皮素-1(endothelin-1，ET-1)的浓度而抑制心肌肥大[4]。大鼠心肌细胞有内皮素特异性受体，在培养新生大鼠心肌细胞中，ET-1可诱导心肌肥大、增加蛋白质的合成，是引起心肌肥大的因子[5]。而PGZ可能减少了随后Na+/H+交换和Na+/Ca2+交换的激活，抑制钙的内流，减轻细胞的钙超载，进而抑制了ET-1引起的心肌肥大[6]。PGZ还可以降低心肌细胞丙二醛含量，说明PGZ可以抑制脂质过氧化的作用，即PGZ在高胆固醇血症中保护心肌细胞的损伤可能与抗氧化作用有关[7]。本实验证实，PGZ可以通过抑制细胞凋亡发挥心肌保护作用，但是其抑制细胞凋亡的具体机制尚不明确。

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