增殖细胞核抗原在涎腺粘液表皮样癌中的表达及其临床意义*

王 青

(泰山医学院附属泰山医院病理科，山东 泰安 271000)

粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma, MEC)是涎腺最常见的恶性肿瘤之一，占涎腺肿瘤5%～12%，好发于腮腺。手术切除是其治疗的主要方法，但术后易局部复发及转移是预后不良的主要原因。肿瘤术后的复发转移是一个多步骤的连续性的过程，肿瘤细胞的恶性增殖是其中的一个重要方面。随着肿瘤增殖动力学研究的不断深人，通过细胞增殖活性检测来评价肿瘤的恶性度、预测预后的可能性成为一种趋势。本实验采用免疫组化技术(SABC法)对涎腺粘液表皮样癌的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达及其临床意义进行探讨。

1 材料与方法

1.1 临床资料及切片制备

30例涎腺粘液表皮样癌组织均取自我院1984年～2010年手术切除标本蜡块，患者年龄27～72(平均51.7)岁，男11例，女19例，颈部淋巴结转移与否以术后病理检查结果为准。所有患者术前均未接受化疗或放疗， 根据WHO的MEC分级标准[1]，高分化21例，低分化9例。其中大涎腺粘液表皮样癌20例，小涎腺粘液表皮样癌10例。有淋巴结转移4例，无淋巴结转移26例。蜡块制备5μm厚连续切片，抗PCNA单克隆抗体进行免疫组织化学染色，并做常规苏木精-伊红染色。

1.2 免疫组化染色

第一抗体PCNA为武汉博士德公司提供，3,3-二氨基苯联胺(DAB)为Sigma公司产品，染色方法参照试剂盒说明按SABC法进行。分别用1.5%正常兔血清和0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)取代第一抗体作为替代对照和空白对照。用己证实 PCNA染色阳性的乳粘液表皮样癌切片作阳性对照。

1.3 PCNA标记指数(proliferating cell nuclear antigen label index，PLI)

绝大多数阳性细胞以胞核棕褐色染色，颗粒状或弥散(图1)，部分也可胞质着色。观察500个肿瘤细胞，PCNA阳性细胞数所占的百分数即为PLI。

图1 PCNA阳性细胞核内含有棕褐色颗粒(免疫组化DAB染色×400)

Fig1 There was a cytoplasmic staining of the tumour cells(DAB staining,×400)

1.4 统计学方法

应用SPSS13.0软件进行数据处理，PCNA表达与临床病理的关系用X2检验。

2 结 果

PCNA染色定位于细胞核，细胞核被染成棕黄色或褐色，核显色较深时，细胞质着色较浅，染色方式呈颗粒型或弥漫型，以前者多见。在涎腺粘液表皮样癌不同分化程度或癌的不同区域，PCNA阳性细胞数量和分布呈异质性。高分化粘液表皮样癌阳性细胞主要围绕在癌巣周边和浸润前缘，低分化粘液表皮样癌阳性细胞很密集，分布无规律性。

30例涎腺粘液表皮样癌 PLI的均数为(75.47士17.83)%，范围在21%～93%。以PLI平均值分为低25例(21%～57%)、高22例(57.01%～93%)两组进行分析。PCNA表达与涎腺粘液表皮样癌临床病理因素的关系见表1。

表1 PCNA的表达与临床病理因素的关系

3 讨 论

细胞增殖的评估是肿瘤的组织学分类所依据的重要指标，与肿瘤的治疗和复发有着潜在的相关性。PCNA是一种分子量为36kD的酸性核蛋白，是DNA聚合酶的辅助蛋白[2], 定位于20号染色体上。含有6个外显子与5个内含子，长约7.0Kb，在内含子之间及内含子与外显子之间存在大量重复序列，在5'端和3'端存在广泛的侧翼序列，这些侧翼序列参与细胞内的某些调控并受控于其他基因和细胞因子。PCNA与细胞增殖状态明显相关，是伴随细胞增殖而表达的一种核内蛋白。PCNA在增殖细胞中的含量变化有明显的周期性，在静止细胞中量很少,G1晚期开始增加，S期达高峰，G2、M期明显下降。这种变化与细胞内DNA复制的时相变化一致，说明其表达程度与细胞增殖周期关系密切，因此作为评价细胞增殖活性的指标之一[3]。肿瘤生长不仅是病变体积的增长，更重要的是细胞增殖活性发生变化，增殖活性是了解肿瘤生物学行为的一个有用的辅助手段。肿瘤细胞增殖活性的增加可能导致多克隆亚群的产生并有助于其中的某些亚群获得浸润、转移的能力。在包括结肠癌、肺癌、甲状粘液表皮样癌、胃癌的许多恶性肿瘤中，增殖活性与肿瘤转移潜能、复发均有显著相关性[4]。

不同分化程度的粘液表皮样癌有着明显不同的临床表现和预后。目前一般根据其分化程度判断恶性程度。WHO对粘液表皮样癌分化程度的病理诊断标准为，高分化粘液表皮样癌，粘液细胞数量50%,表皮样细胞分化好,低分化粘液表皮样癌，肿瘤主要由未分化的中间细胞或分化差的表皮样细胞构成，粘液细胞数量不足10%[1]。有些病例，组织病理学上精确地判定其细胞组成比较困难，其组织病理学的分级不够客观，使得组织病理学诊断有时和临床的生物学行为表现不一致。近年来，有些研究报告[5]用生物学标记物试图区分其恶性程度以获得更客观的评估。Zhu等[6]认为PCNA的表达指数是区分涎腺肿瘤良恶性可靠的标记物。Cardoso等[7]认为PCNA的表达可作为粘液表皮样癌分级辅助方法。

目前对涎腺粘液表皮样癌生物学行为的判断仍主要靠组织学分级和临床分期，但受主客观因素的影响，由于涎腺粘液表皮样癌术后局部复发及转移是预后不良的主要原因，所以寻找可靠、准确的判定预后的指标已成为涎腺粘液表皮样癌生物学行为研究的重点之一。本研究结果表明，PCNA指数与涎腺粘液表皮样癌的组织分化程度相关，这与子宫内膜癌、胃癌报道结果一致〔8，9，10〕。在组织分化程度高的肿瘤中PCNA阳性细胞数少，染色较淡，呈棕色，而肿瘤组织分化程度低者，PCNA表达量高，染色加深呈棕褐色，有时呈颗粒状，反映出肿瘤细胞增殖活性和分化的一般规律，提示PCNA高表达者细胞增生活跃，生长繁殖能力更强，其分化差，恶性程度高。

本实验还显示，PCNA 表达与涎腺粘液表皮样癌的淋巴结转移呈显著的相关性，这与胃癌报道结果一致[11]，说明增殖活性较高的肿瘤更易发生淋巴结转移。以上表明PCNA在常规病理切片上能敏感检测肿瘤细胞增殖活性或状态，是判断涎腺粘液表皮样癌患者预后的良好指标。这在其它肿瘤检测中也有类似发现报道。PCNA免疫反应能原位检测肿瘤细胞增殖活性，其方法简便、重复性强，除可进行细胞动力学研究外，对指导临床肿瘤化疗和放疗，判断预后都具有重要价值。检测涎腺粘液表皮样癌PCNA的表达可用于判断其恶性程度及预后，PCNA高表达者需严密随访，并加强术后辅助治疗。

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