转化生长因子-β1在糖尿病大鼠骨折愈合过程中的实验研究*

江新泉 刘洪爱 陈 强 高永峰 李 冬 李 峰

(1. 湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.泰山医学院，山东 泰安 271016； 3.泰山疗养院，山东 泰安 271000；4.中国人民解放军第八十八医院，山东 泰安 271000 )

随着人民生活水平的提高，糖尿病病人越来越多。在此情况下，因交通事故和各种意外伤害造成糖尿病病人的各种类型骨折也呈快速上升趋势。给病人带来极大痛苦,严重影响病人的生活质量和生命健康。TGF-β是一个有效的趋化因子,同时刺激间充质干细胞和软骨细胞、成骨细胞的增殖。有关TGFβ1在糖尿病大鼠骨折愈合过程中的作用未见报道。为此我们通过观察糖尿病大鼠骨折后血清中TGF-β1水平,为探讨TGF-β1对糖尿病骨折愈合影响的机制，提供一些动物实验资料。

1 材料和方法

1.1实验仪器和试剂 链脲菌素 (STZ)由美国 Sigma公司生产, ELISA法检测TGF-β1 的水平试剂盒 (批号20090118114)，由北京中山生物技术公司提供。酶标仪、洗板机由泰山医学院公共卫生学院实验室提供。

1.2糖尿病骨折动物模型制备 雄性SD大鼠40只 由泰山医学院动物实验中心提供,体重为158～245g,随机分为两组。实验组：25只大鼠腹腔内注射链脲佐菌素65 mg/kg体重,定向破坏胰岛细胞,3天后测血糖高于16.8 mmol/l,并出现多饮、多尿症状为者为糖尿病大鼠造模成功[1]。实验过程中每次测血糖,血糖值高于此值者用于试验，造模过程死亡10只，成功15只，随机分成各实验组。 对照组：大鼠15只腹腔内注射等容量的生理盐水。两组大鼠均折断右小腿造成胫排骨骨折,然后进行复位夹板外固定,去附属医院X线片证实复位满意。实验期间各组大鼠均自由饮水,进食。术后第1W 、2 W、4W 周各取大鼠5只,麻醉,腹主动脉取血,分离血清后-80℃冰箱保存待测。拍X 线片观察骨痴生长情况 。

1.3血清 TGF-β1含量的测定 用抗大鼠 TGF-β1mAb包被酶标板,加入待测血清及 TGF-β1 标准品温育,洗涤后加入辣根过氧化物酶 (HRP)标记的抗大鼠 TGF-β1多克隆抗体,加底物显色液,用酶标仪测A450 nm值,求得样品 TGF- β1相对含量.

2 结 果

2.1血糖及体重变化 糖尿病骨折组大鼠行动迟缓, 出现多饮、多尿、明显消瘦症状，血糖值维持在较高水平(平均22.7士1.38mmol /L)。正常对照组骨折大鼠，精神状况尚可，没有上述症状，血糖值维持在正常水平 (平均5.60士0.08 mmol/L)。

2.2X线片观察 第1周X线片实验组骨折处未见明显骨痴影，而对照组可见少量稀疏骨痴影。第2 周对照组骨折处内已形成明显骨痴影，且密度一致,实验组骨痴亦形成，较对照组密度低。第4周两组大鼠骨折处骨痴影密度都有所增加,但实验组骨痴影仍低于对照组,图1 。

实验组 (4W) 对照组 (4W)

2.3糖尿病骨折大鼠不同时间段TGF -β1水平，结果如下表

表 大鼠各时间段TGF-β1的检测值

与对照组*P<0.01

3 讨 论

骨折愈合包括细胞生长因子对细胞分化和增殖的调控作用以及细胞生长因子的骨诱导、 分子信号传导作用等，同时也包括细胞迁移、 血管生成和骨痂改建等。它是一个复杂的生理过程 、修复过程，受多种因素交互作用的影响。

TGF-β是一族具有多种功能的蛋白多肽，广泛存在于多种组织及转化细胞中，其中以骨组织、血小板、软骨组织中含量最丰富[2]。已知至少有 5 种异构体( TGF1～5 )。转化生长因子-β1 (TGF-β1 )是由两个β1 亚单位组成的同型二聚体多肽,基因为 100kb,具有广泛的生物学功能[3]。同时TGF -β1在组织的损伤中具有促进纤维合成作用又在组织修复中起作用，且许多细胞都能分泌 TGF-β1,如成骨细胞、成纤维细胞和软骨细胞等。其中TGF -β1是超TGF-β家族中的一个关键调控分子, 它除了直接刺激成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞外, 还能够强化其他骨生长因子的作用, 例如BMP 和类胰岛素生长激素(IGF)[4]

在本实验中通过X线片观察到第1周X线片实验组骨折处未见明显骨痴影，而对照组可见少量稀疏骨痴影。第2 -4周两组大鼠骨折处骨痴影密度都有所增加,但实验组骨痴影一直低于对照组，表明实验组大鼠在骨折愈合的发生时间上较对照组有所延迟。提示糖尿病可能影响骨痂内不同细胞的增殖、分化及其生物学作用。

本次研究表明，糖尿病大鼠骨折发生的早期(1～ 4 周)，实验组外周血的TGF-β1 水平始终显著低于对照组(P<0.01)。发生骨折的前2 周,各组大鼠的外周血TGF-β1 水平都有显著升高(P<0.01)。在2～ 4 周间, 实验组大鼠的外周血TGF-β1 水平出现明显下降(P<0.01)。说明TGF-β1在骨和软骨形成、骨折愈合及其它骨骼肌肉组织的修复中发挥着重要作用。

骨折愈合时, 并非仅是局部的生长因子合成、释放, 而是全身性的系统反应来激活骨折部位的新生和修复, 如果机体的生长因子供应不足会导致骨质流失, 减缓成骨细胞的分化[5]。,糖尿病骨折大鼠骨折愈合过程中 TGF -β1 的变化有一定规律，因此，我们预测血TGF -β1 水平可能成为骨折愈合中的敏感指标之一,为判断糖尿病骨折愈合进展、骨折延迟愈合、骨不连等提供实验数据，也有利于从分子水平了解骨折愈合的调控机制，但对各生长因子、炎症因子之间的相互关系尚有待进一步探讨和研究。

[1] 余臣祖,张朝宁.实验性2型糖尿病动物模型研究进展[J].医学综述, 2006,12(1): 41-42.

[2] 俞猛.生长因子在骨折愈合中的作用[J].中国矫形外科杂志, 2004, 12(3): 279-281.

[3] Batalle R, Brenner DA. L iver fibrosis[J]. J Clin Invest,2005,115 (2) : 209-218.

[4] Schm idmaier G,W ildemann B, Gabelein T, et al . Synergistic effect of IGF-I and TGF-betal on fracture healing in rats: single versus combined app lication ofIGF-I and TGF- betal [J]. A cta Orthop Scand, 2003, 74: 604-610 .

[5] Brager M A, Patterson M J, Connolly J F, et al. Osteogenic growth peptde normally stimulated by blood loss and mar rowablation has local and systemic effects on fracture heaiing in rats[J]. J O rthop Res, 2000, 18: 133-139 .