促红细胞生成素对缺氧缺血新生鼠脑组织一氧化氮水平及细胞凋亡的影响*

姜荣燕 陈淑英 李希红

(泰山医学院附属医院小儿内科， 山东 泰安 271000)

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是新生儿窒息、缺氧的严重并发症，易留下脑性瘫痪、智力障碍、癫痫等神经系统后遗症。近年研究表明，促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)具有神经保护、神经营养作用。本实验在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型上观察外源性EPO对一氧化氮(nitric oxide,NO)水平及脑细胞凋亡的影响，来探讨EPO在HIBD中的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1新生7 日龄Wistar大鼠,性别不限,体重12～16g,共101只,山东大学实验动物中心提供；缺氧舱及测氧仪由泰山医学院儿科提供；重组人促红细胞生成素(RhEPO) 由深圳新鹏生物工程有限公司提供，产品批号20070901；测定NO的试剂盒及细胞凋亡试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1新生大鼠HIBD 模型的制备：按Rice法制作, 出生7日的Wistar大鼠，乙醚吸入麻醉后取颈正中切口,分离并以丝线结扎左侧颈总动脉,术后恢复2～3h，后置于2 L密闭容器,于37℃水浴中,以2～3 L/min的速度输入含8%氧气和92%氮气的混合气体,持续2 h。

1.2.2实验动物分组：101只Wistar大鼠随机分成3组，假手术组(n=25)仅游离左侧颈总动脉而不结扎，不低氧；对照组(生理盐水组)(n=38)在模型制备后腹腔注射生理盐水0.5ml/只；实验组(RhEPO组)(n=38)在模型制备后腹腔注射RhEPO 4000u/kg/只[1]，RhEPO稀释到0.5 ml。

1.2.3标本的制备及检测：假手术组于处置后，对照组与实验组分别于注射药物后2h，12h，24h，48h，72h，96h断头取左侧脑组织称重，按重量体积比1：9加生理盐水制成10%脑组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液用硝酸还原酶法测定NO；各组均于术后24h，自丘脑中1/3平面行冠状切片，4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片，Tunel染色，不加标记溶液的为阴性对照，具体操作按说明书进行。观察各组大鼠海马区锥体细胞核中含有棕色颗粒的阳性细胞数。

2 结 果

2.1脑组织中NO检测结果：

以假手术组为正常对照，对照组于HIBD后2h即升高(P<0.05)，12-96h显著高于假手术组，差异有显著性意义(P<0.01), 最高值出现在72h，72h后NO值开始下降。实验组各时相NO值均低于对照组，24-96h与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01)，见表1。

2.2Tunel染色结果

Tunel染色检查假手术组及阴性对照组海马区锥体细胞排列整齐，未见凋亡细胞；对照组凋亡细胞阳性细胞数(118.91±12.32)明显高于实验组(59.24±4.92), 差异有显著性意义(t=3.45,P<0.01)。

表1 三组HIBD后脑组织NO水平变化的比较蛋白)

注：与假手术组比较，aP<0.05，*P<0.01，与对照组比较#P<0.01

3 讨 论

EPO是一种耐热的含唾液酸的酸性糖蛋白，它通过作用于红系祖细胞膜表面特异性受体而刺激其增殖、分化及成熟，近年来研究发现，在大脑皮质、小脑、海马、腺垂体、脊髓中也存在EPO和EPO受体( erythropoietin receptor, EPOR)，神经元和神经胶质细胞均表达EPOR[2]，EPO的合成和释放受多种因素调控，组织缺氧、缺血是产生EPO的始动因素，脑缺氧、缺血时通过低氧诱导因子( hypoxia-in-educible factor-HIF-1)的作用，引起EPO和EPOR在神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞表达增加[3]，缺氧缺血时EPO的高表达提示它有内源性神经保护作用。但在脑损伤时内源性EPO数量不足或不能很快生成,使它不能及时发挥神经保护作用，于是，人们开始探讨应用外源性EPO来保护缺氧缺血脑组织。

EPO对HIBD保护作用的机制尚不明确，近期有人[4]比较用RhEPO 治疗的HIBD新生鼠脑组织匀浆的NO 及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)水平均比对照组有所降低，说明外源性给予RhEPO 可减少NO的生成。NO是一种高度游离的气体分子，早期虽然可激活鸟苷酸环化酶，而具有调节脑血管张力及参与细胞信息传递等作用，但过度合成会导致神经毒性作用。大脑缺氧缺血后，可因激活钙依赖的NOS合成大量N0，过量的NO与O2反应，产生毒性更大的过氧化氮(ONOO-),后者是一种高毒性自由基；而非钙依赖性的诱导型NOS(iNOS)也可在神经损伤后激活，在缺血再灌注损伤过程中主要是iNOS产生NO而导致神经毒性作用[5]。本研究显示，对照组于HIBD后2h NO水平开始升高，12h尤其是24h后NO水平继续升高，最高值出现在72-96h，说明脑组织缺氧缺血后生成大量的NO，且随着缺氧缺血时间的延长生成量增多；实验组各时相NO值均低于对照组，24-96h与对照组相比有统计学意义(P<0.01)，表明RhEPO可抑制NO的过量合成，对HIBD有一定的保护作用。

神经细胞凋亡在HIBD的发病中起重要作用，本研究通过Tunel染色证实经RhEPO处理的HIBD新生鼠海马区细胞凋亡数明显低于对照组，提示RhEPO抑制HIBD所致的细胞凋亡是发挥脑保护作用的重要环节。其机制[6]为缺氧后HIF-1迅速激活，进而星形胶质细胞等表达释放EPO，EPO与EPOR结合，使EPOR形成二聚体, 通过磷酸化作用激活JAK2，JAK2激活后,可导致几种下游传导途径激活,包括Ras蛋白-丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyliNOsitol 3-kinase,PI3K) 途径及信号转导与转录活化因子5 (signal transducers and activators of transcription,STAT-5) 途径，将信号逐步下传，最终抑制神经元凋亡 。细胞凋亡受多种相关凋亡基因的调控，其中，Bcl-2基因家族及其编码的蛋白质在细胞凋亡调控过程中起着重要作用，如抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl，促凋亡蛋白Bax、Bak等， Kumral等[7]研究发现EPO可通过下调Bax的表达,逆转缺血缺氧引起的Bcl-2表达的减少,而抑制新生儿HIBD引起的细胞凋亡。

总之，RhEPO可抑制新生鼠HIBD时脑组织NO的过量产生及神经细胞凋亡，对HIBD起保护作用，这可能是因为外源性EPO虽不易透过完整的血脑屏障，但由于新生动物血脑屏障发育不完善，同时缺氧缺血本身进一步损伤血脑屏障，从而能使外源性EPO进入脑组织发挥生物效应。目前RhEPO已应用于临床，证实早期治疗中、重度新生儿HIE能改善神经系统症状,促进病情的恢复,且无明显不良反应[8]，因此，RhEPO的应用将为新生儿HIE提供一个崭新的治疗途径。

[1] 谭玲，陈娟，廖志.EPO对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤核因子-κB表达的影响.中国新生儿科杂志，2008，23：287-289

[2] Siren AL，Knerlich F，Poser W，et al. Erythropoietin and erythropoietin receptor in human ischemic-hypoxic brain. Acta Neuropathol，2001,101(3):271-276.

[3] Bartesaghi S, MariNOvich M, Corsini E, et al. Erythropoietin: a NOvel neuroprotective cytokine. Neurotoxicology,2005,26(5): 923 -928.

[4] 林 燕,王 玲. 促红细胞生成素对缺氧缺血新生鼠脑匀浆一氧化氮及血浆内皮素的响．实用儿科临床杂志,2006,21(6)106-107.

[5] 童秋玲，许国英，吴钢.诱导型一氧化氮合酶与脑缺血.国外医学一脑血管疾病分册,2004, 19 (2):101-102.

[6] Ghezzi P, Brines M. Erythropoietin as an antiapop totic, tissue protective cytokine. Cell Death Differ,2004,11(Suppl1): 37-44.

[7] Kumral A, Genc S, Ozer E, et al. Erythropoietin down regulates bax and DP5 proapoptotic gene expression in neonatal hypoxic-ischemic brain Injury. Biol Neonate, 2005,89(3):205-210.

[8] 康文清，朱长连，熊虹,等. 重组人促红细胞生成素治疗新生儿缺氧缺血性脑病的疗效，实用儿科临床杂志，2006,21:86-87.