非小细胞肺癌组织中β-tubulinⅢ的表达及与含紫杉方案化疗敏感性的关系

李建喆， 丛光东， 杜亚明， 王中彬

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，也是死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中大约有80%为非小细胞肺癌(NSCLC)，且5年生存率不足15%[1]。化疗在肺癌的治疗中有举足轻重的作用，但是相同的药物，用在临床分期相同的患者身上，常会产生截然不同的效果，提示临床疗效取决于药物与肿瘤组织的相互作用。药物遗传学(pharmacogenetics)和药物基因组学(pharmacogenomics)的迅速发展已经证明，肿瘤组织的基因表达情况与NSCLC化疗的疗效相关。因此，根据患者肿瘤组织的基因表达情况选用特异的最佳的化疗药物，以提高化疗的敏感性及延长生存期，并将毒副反应降到最低成为可能[2]。随着对肺癌研究的不断深入，对肺癌的治疗方法也在不断地进步，现已提倡治疗向个体化的方向发展，但目前肺癌的个体化治疗还比较盲目，不能做到有的放矢。因此，加强对肺癌的特异性因子的研究就显得尤为重要，检测并分析其指标对指导临床治疗有重要意义。

微管蛋白是细胞骨架的重要组成部分。其中Ⅲ型β微管蛋白(β-tubulinⅢ)与作用于微管的化疗药物敏感性有最密切的关系[3]。本课题通过SP二步法联合测定NSCLC患者瘤组织内β-tubulinⅢ的表达并观察临床化疗效果，分析二者之间的关系，以期为个体化治疗提供药物选择的参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料 123例NSCLC组织均为2003—2006年辽宁医学院附属第一医院病理科术后存档标本(肺癌组)，术前未经任何放化疗，均有明确病理诊断，术后予以药物辅助化疗。123例患者中男性88例,女性35例；年龄34～80岁,平均58.49岁。所有标本按WHO (1981)组织学分型分级标准：鳞癌75例(其中高分化11例，中分化47例，低分化17例，有淋巴结转移的31例)，腺癌48例(其中高分化33例，中分化10例，低分化5例，有淋巴结转移的26例)。所有病例均按国际肺癌TNM分期(UICC，5thed，1997)：Ⅰ期68例，Ⅱ期42例，Ⅲ期11例，Ⅳ期2例。另选15例2003—2008年炎性假瘤组织作为良性对照组。全部标本常规固定，石蜡包埋，5 μm切片。

本组123例中32例为用含紫杉类化疗药物化疗的晚期非小细胞肺癌患者的标本，化疗方案为TP：紫杉醇(paclitaxel) 135 mg/m2，第一日；卡铂(carboplatin) AUC 5～6，第一日，每21日1次。所有患者至少接受2周期以上的化疗，并且具备完整的临床随访资料。

1.2 检测方法 鼠抗人β-tubulin Ⅲ单克隆抗体(北京中杉生物科技有限公司)。用免疫组化二步法检测两组样本中的β-tubulin Ⅲ。用已知的β-tubulin Ⅲ阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。严格按试剂盒说明书进行操作。

1.3 结果判断 随机选择5个高倍视野，β-tubulinⅢ表达阳性者，均在细胞质中出现棕黄色。按每张切片肿瘤细胞中阳性细胞的比例(A)和着色深浅(B)记分, 行半定量分析。阳性细胞所占比例判断：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度：无着色0分，浅黄色1分, 棕黄色2分，棕褐色3分。根据两项指标积分数(积分=A×B)高低分为：0分为阴性(-)，1～2分为可疑(±)，3～5分为弱阳性(+)，6～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。以-和±为表达阴性，+、++、+++为表达阳性。以上所有结果的判定均在双盲法下进行。

按WHO标准评定疗效：CR为病灶完全消失1个月以上；PR为肿块缩小超过50%，时间4周以上；NC为病灶减小不到50%或无变化或增大25%以下；PD为病灶增大超过25%或出现新病灶。完全缓解或部分缓解者为化疗有效，稳定或疾病进展者为化疗无效。

总生存期(OS)：以电话或门诊随访的方式完整随访32例用含紫杉类化疗药物化疗的晚期NSCLC患者，随访时间17～60个月，随访日期截止到2009年5月25日。观察患者生存期(患者开始化疗日起，至患者死亡或最后1次随访日止)。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0软件处理数据。率的比较用χ2检验；生存曲线分析用Log-Rank检验；P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组β-tubulinⅢ的表达情况 NSCLC组中77例(62.6 %)β-tubulinⅢ表达阳性，良性组中2例(13.3%)β-tubulinⅢ表达阳性，两组间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 β-tubulinⅢ在NSCLC与对照组中的表达

2.2 β-tubulinⅢ表达水平与NSCLC临床病理特征的关系 β-tubulinⅢ表达阳性率在低分化期大于中高分化期(χ2=6.46，P<0.05)；在临床分期中，β-tubulinⅢ在Ⅲ～Ⅳ期的表达阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期，组间比较差异有统计学意义(χ2=4.29，P<0.05), β-tubulinⅢ的表达在年龄、性别、组织类型、淋巴结转移方面的差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

表2 β-tubulinⅢ表达水平与NSCLC临床病理特征的关系

2.3 β-tubulinⅢ对术后化疗效果的预测 选取肺癌组中术后予含紫杉类药物辅助化疗并具备完整随访资料的32例，将β-tubulinⅢ指标分为阳性、阴性2组。其中β-tubulinⅢ表达阳性者16例，其1、2、3年生存率分别为68.75%、18.75%和0，中位生存期为18个月；阴性者16例，其1、2、3年生存率为87.5%、56.25%和31.25%，中位生存期为27个月。两组1、2、3年生存率比较，χ2=5.12，P<0.05，差异有统计学意义。

3 讨论

迄今为止，NSCLC的化疗效果仍然不太理想，在目前常用的化疗方案中尚无效果显著的方案。肺癌细胞出现耐药性是影响化疗疗效的主要因素，多药的耐药(MDR)可能是导致NSCLC化疗失败的主要原因。若能前瞻性地进行分子指标的检测，预测药物的疗效及预后，就可能做到个体化治疗及判定预后。

微管蛋白(tubulin)主要分为α、β两个亚型，是细胞骨架和纺锤体的主要成分，在细胞有丝分裂、细胞器组成与运输及信号传导等方面发挥重要作用，是许多抗肿瘤药物的作用位点，并可以出现获得性耐药[4-5]。人类细胞中存在着6种β-tubulin的同型，其中Ⅲ型β-tubulin与作用于微管的化疗药物有密切关系[6]。研究发现，β-tubulinⅢ在正常组织和癌组织中都有表达，但在癌组织中表达的量要远远高于正常组织中的量，β-tubulinⅢ表达水平高的患者，其化疗效果及生存期要低于表达低的患者[7]。

本研究结果显示，β-tubulinⅢ主要表达在细胞浆内，在NSCLC中表达高，并与分化程度及临床分期密切相关(P<0.05)；而与患者年龄、性别、肿瘤病理类型和有无淋巴结转移无关。提示β-tubulinⅢ阳性表达可能与肺癌的发展有着重要的相关性,与细胞的增殖和分化有关，其有可能成为人类肺癌生物治疗的一个新靶点。

紫杉类化疗药物作为抗微管解聚的细胞毒类药物，1992年被美国FDA批准在临床上使用。紫杉类药物主要作用于细胞G2晚期和M期末，它虽可促进微管蛋白装配成微管，却同时抑制微管的裂解，导致微管排列异常，使纺锤体失去正常功能而引起细胞死亡[8]。目前认为，紫杉类化疗药物出现耐药的原因主要是β-tubulinⅢ的过表达及β-tubulin的基因突变。Pascal等[9]研究认为β-tubulinⅢ过表达者对紫杉类化疗药物的敏感性下降，导致疗效降低，但其机制还不清楚，可能是β-tubulinⅢ过表达降低了紫衫类化疗药物抑制微管蛋白解聚的效应而诱导耐药。本研究显示，β-tubulinⅢ呈阳性表达的患者的生存率和生存期较阴性表达者下降(P<0.05)，提示β-tubulinⅢ呈阳性表达的患者对紫杉类化疗药的敏感性较呈阴性表达者差，患者术后的预后较差。

综上所述，过表达β-tubulinⅢ可引起肿瘤细胞对紫杉类化疗药物敏感性降低。β-tubulinⅢ能作为预测患者对紫杉类药物化疗疗效的指标，能为NSCLC患者个体化治疗提供一定的指导。但是，本实验只局限在与紫杉类药物的作用关系，与其他化疗药物的关系还不明确，还需要进一步研究证实。

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