胃癌术中腹腔冲洗液CK19检测临床意义的探讨

刘振芳， 刘宏斌， 韩晓鹏， 苏 林， 魏登文

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，胃癌的微转移与其复发、转移及预后均密切相关。微转移目前尚无统一的定义，一般是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血液系统、骨髓、肝、胰等组织器官中的微小肿瘤细胞。这些细胞尚未形成转移结节，常规病理检查(如HE染色)难以发现，一般无任何临床表现，但微小的肿瘤细胞会迅速生长成为新的转移灶[1-2]。胃癌术后疗效失败的主要原因为腹膜转移或复发，自1987年腹腔镜应用于胆囊切除术以来，由于其微创优点，应用范围已逐渐扩展到外科的各个领域。腹腔镜下胃癌根治术能否达到根治要求，术中是否造成癌细胞脱落，尚存在分歧，细胞角蛋白19(cytokeratin,CK19)因其具有严格的上皮组织特异性，局限于胃肠上皮细胞，且几乎所有的胃癌都明显表达并在侵袭、转移、扩散到其他组织器官(包括腹腔冲洗液)过程中始终表达，已经成为众多研究胃肠道恶性肿瘤微转移的检测指标之一[3-4]。本研究通过检测50例胃癌患者手术前后腹腔冲洗液中CK19表达的情况，分析CK19与肿瘤组织分化程度、TNM分期的关系，并探讨腹腔镜胃癌根治术对腹膜微转移的影响。

1 对象和方法

1.1 研究对象 选择2008年7月至2009年10月我科收治的经病理确诊的50例胃癌患者为研究对象，分为开腹组及腹腔镜组。开腹组采用传统方法开腹行胃癌根治术，共有患者29(男15，女14)例，年龄30～81(平均59)岁；高中分化腺癌21例，低分化腺癌8例；pTNM分期Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ期7例。腹腔镜组在腹腔镜辅助下行胃癌根治术，患者21(男13，女8)例，年龄33～70 (平均51)岁；高中分化腺癌14例，低分化腺癌7例；pTNM分期Ⅰ+Ⅱ期12例，Ⅲ期 9例。另选择同期胃良性疾病接受手术的患者10(男6，女4)例，年龄18～45(平均34)岁，作为正常对照组。纳入标准均按国际抗癌联盟(UICC，2002)公布的临床病理分期标准。所有患者均无远处转移，无化疗和免疫药物治疗史，具备手术指征，可获根治性切除。腹腔镜组先建立人工CO2气腹，常规探查腹腔内脏器，明确无腹内脏器转移及腹腔种植。

1.2 标本的收集 开腹组在开腹后(简称术前，下同)及消化道重建后(简称术后，下同)，分别于Douglas窝及左膈下置1根16号导尿管，注入150 mL无菌生理盐水，在不触动原发灶的情况下，轻轻搅动后吸出，如有自然腹水则直接吸出(以肝素抗凝)。腹腔镜组在建立人工气腹后(术前)经腹部戳孔放入输尿管，如有腹水直接吸出，如无腹水则经导尿管注入无菌生理盐水150 mL后吸出，另在手术结束前(术后)再次取样。正常对照组在开腹后同法收集腹腔冲洗液。收集的腹腔冲洗液于1 500 r/min离心5 min后，取沉淀行FCM检查(前处理和CK19的检测应在6 h内完成)。

1.3 流式细胞学检测CK19 待检细胞悬液于300目滤网过滤，调整细胞浓度至1×106个/mL，分别加入单克隆抗体CK19-FITC(28-MCA1744F)及阴性对照IgG1-FITC(28-MCA928F)(均购自Serotec公司)。详细操作按说明书进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件包，χ2检验或确切概率法统计，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术前术后腹腔冲洗液CK19表达情况(表1) 胃癌患者术前腹腔冲洗液CK19阳性表达率(34.0%，17/50)明显高于正常对照组(0，0/10)，P<0.05。胃癌患者术后腹腔冲洗液CK19阳性表达率(38.0%，19/50)较术前虽有所增加但差异无统计学意义。开腹组腹腔冲洗液CK19检测术前阳性10例、术后阳性11例，术后检测阳性例数虽较术前增加但差异无统计学意义。腹腔镜组腹腔冲洗液CK19检测术前阳性7例、术后阳性8例，术前与术后比较差异亦无统计学意义。开腹组术后与腹腔镜组术后腹腔冲洗液CK19的检测差异无统计学意义。

表1 术前术后腹腔冲洗液中CK19表达的情况

2.2 TNM分期与腹腔冲洗液中CK19表达的关系 Ⅰ+Ⅱ期患者的CK19阳性表达率，腹腔镜组术前(25.0%，3/12)与开腹组术前(22.7%，5/22)差异无统计学意义。Ⅲ期患者的CK19阳性表达率，腹腔镜组术前(55.6%，5/9)与开腹组术前(57.1%，4/7)的差异也无统计学意义。Ⅲ期患者术前CK19阳性表达率(56.3%，9/16)明显高于Ⅰ期+Ⅱ期(23.5%，8/34)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 腹腔冲洗液CK19表达与癌组织分化程度的关系 从表2中可看出在低分化腺癌的腹腔冲洗液中CK19阳性表达率明显高于高中分化腺癌组(P<0.05)，但手术前后比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 CK19检出情况和癌组织分化程度的关系

3 讨论

自1978年腹腔镜应用于胆囊切除术以来，由于其微创优点，应用范围逐渐扩展到外科各个领域。腹腔镜胃癌手术和传统开放胃癌手术比较，在淋巴结清扫、肿瘤复发率、转移率和患者生存率等方面无明显差异[5]，但手术操作对肿瘤细胞微转移的影响尚存有争议。流式细胞术是一种先进的细胞分析仪，采用计算机、激光和荧光标记单克隆抗体技术，能在短期内对大量标本进行检测，具有快速、灵敏的特点。可在10个外周血中检测到1个癌细胞，能快速定量、定性分析细胞，已成为肿瘤研究重要的手段之一，并广泛应用于肿瘤的基础和临床研究中[6]。我们的研究显示腹腔镜组术前CK19阳性表达率(0.33%，7/21)较术后(0.38%，8/21)虽有所增加，但差异无显著性。开腹组与腹腔镜组术后的CK19阳性表达率亦无显著性差异。Huscher等[7]回顾性研究100例行腹腔镜胃癌根治手术患者，其中11例行根治性全胃切除术，89例行根治性胃部分切除术，术后病理分期ⅠA期21例，ⅠB期20例，Ⅱ期17例，ⅢA期17例，ⅢB期5例，Ⅳ期20例，术中平均清扫淋巴结35枚，结果显示腹腔镜胃癌根治术用于治疗早期及进展期胃癌安全、有效，能达到胃癌的根治效果。本研究显示腹腔镜胃癌根治术并不增加腹腔微转移的机率，证实在肿瘤的根治性上腹腔镜手术和传统根治手术一样可靠。

本研究中胃良性疾病腹腔冲洗液中均无CK19表达，表明CK19具有很高的特异性。同时，胃癌患者腹腔冲洗液中CK19阳性表达与TNM分期呈正相关，随着病情的发展CK19阳性表达率增加。这一结论与国内吴晴等[8]报道基本相符。我们还发现，腹腔冲洗液中CK19阳性表达率与肿瘤分化程度有关，低分化组明显高于高中分化组，显示CK19作为肿瘤转移标志物其高表达与肿瘤组织的恶性程度相关。

本研究中胃癌患者术前腹腔冲洗液中CK19阳性表达率为34.0%，阳性率较低，可能与腹腔冲洗液中肿瘤细胞过少、所纳入病例多数属Ⅰ、Ⅱ期有关，我们认为可以通过增大标本量和重复检测以及规范操作等方法提高 CK19阳性检出率和减少假阴性。

综上所述，通过检测腹腔冲洗液中CK19表达情况可初步证实腹腔镜胃癌手术操作不增加腹腔癌细胞微转移，能够取得与开腹胃癌根治术同样的疗效。但关于腹腔镜胃癌根治术的远期疗效还需要回顾性研究、大宗的病例分析及术后随访结果。

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