温阳解郁颗粒对皮质酮损伤型小鼠海马神经元HT22细胞的保护作用

［摘要］ 目的： 通过体外构建小鼠海马神经元HT22细胞皮质酮损伤模型，探究温阳解郁颗粒对海马神经元细胞的保护作用。方法： 将HT22细胞分为正常组、模型组、温阳解郁组和氟西汀组，除正常组外，其余各组细胞均经皮质酮处理，温阳解郁组、氟西汀组给予相应的含药血清作用24 h，模型组用10%的空白血清培养24 h。CCK-8法检测细胞存活率，倒置显微镜观察细胞形态，酶联免疫法检测LDH活性，Hoechst染色法观察细胞存活数，免疫荧光法检测Brdu、Neun荧光表达并观察HT22细胞的再生情况，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果： 与正常组相比，模型组HT22细胞受损严重、细胞数量减少、存活率显著降低（ P lt;0.01），LDH含量显著升高（ P lt;0.01），Brdu/Neun双染荧光强度显著降低（ P lt;0.01），细胞凋亡率显著升高（ P lt;0.01）；与模型组相比，温阳解郁颗粒含药血清作用于皮质酮损伤HT22细胞后，HT22细胞存活率升高（ P lt;0.05），LDH含量降低（ P lt;0.05），细胞凋亡率降低（ P lt;0.01），Brdu/Neun荧光强度增强（ P lt;0.05）、阳性细胞数显著增加（ P lt;0.01）。结论： 温阳解郁颗粒可能通过修复受损海马神经元细胞，调控神经可塑性，抑制海马神经元细胞凋亡，同时分化生成新的神经元细胞，进而发挥抗抑郁的作用。

［关键词］ 温阳解郁颗粒；抗抑郁；皮质酮；免疫荧光法；细胞凋亡

［中图分类号］ R285.5" ［文献标志码］ A" ［文章编号］ 1671-7783（2025）01-0046-06

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230255

［引用格式］孟霜， 史敏， 冯振宇， 等. 温阳解郁颗粒对皮质酮损伤型小鼠海马神经元HT22细胞的保护作用［J］. 江苏大学学报（医学版）， 2025， 35（1）： 46-51.

［基金项目］山西省基础研究计划青年科学研究项目（20210302124565）；山西中医药大学科技创新能力培育计划“太行本草”专项（2022PY-TH-14）；山西省中医药管理局科研课题（2023ZYYA020）

［作者简介］孟霜（1985—），女，主管药师，硕士，主要从事中药药效物质基础研究；赵杰（通讯作者），主任医师，教授，E-mail： zhaojiemyt@163.com

Protective effect of Wenyang Jieyu granule on HT22 cells of the hippocampal neurons in mice damaged by corticosterone

MENG Shuang¹ ， SHI Min² ， FENG Zhenyu¹ ， MA Xiaojuan¹ ， ZHAO Jie¹

（1. Chinese Medicine Preparation Research and Development Laboratory， Shanxi Integrated Chinese and Western Medicine Hospital， Taiyuan Shanxi 030013; 2. Beijing Leadingpharm Medical Technology Company， Beijing 100089， China）

［Abstract］ Objective： To explore the antidepressant effect and underlying mechanism of Wenyang Jieyu granule （WYJY） by constructing a corticosterone （CORT） injury-induced depression model in mouse hippocampal neurons （HT22） "in vitro . Methods： HT22 cells were divided into normal group， model group， WYJY group，and fluoxetine group. Except for the normal group， HT22 cells in the other groups were treated with CORT. WYJY group and fluoxetine group were treated with corresponding drug-containing serum for 24 hours. The HT22 cells in model group added 10% blank serum for 24 hours. CCK-8 method was used to detect cell survival rate. Cell morphology was observed under a microscope. Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect LDH release. Hoechst staining was used to observe the survival number of cells. Immunofluorescence assay was used to detect the fluorescence expression of Brdu and Neun and observe the regeneration of HT22 cells. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells. Results： Compared with the normal group， HT22 cells in the model group were severely damaged， the number of cells decreased， and the survival rate was significantly decreased （ P lt;0.01），LDH release was significantly increased （ P lt;0.01），the fluorescence intensity of Brdu/Neun double staining decreased significantly （ P lt;0.01）， and the apoptosis rate increased significantly （ P lt;0.01）. Compared with the model group， the survival rate of HT22 cells was increased after the effect of serum containing WYJY on CORT injury （ P lt;0.05），the LDH release and apoptosis rate were decreased （ P lt;0.05， "P lt;0.01），the fluorescence intensity of Brdu/Neun and the number of positive cells were significantly increased （ P lt;0.05， "P lt;0.01）. Conclusion： WYJY may play an antidepressant role by repairing damaged hippocampal neuron cells， regulating nerve plasticity， inhibiting apoptosis of hippocampal neuron cells and differentiating into new neurons.

［Key words］ Wenyang "Jieyu granule; antidepressant; corticosterone; immunofluorescence; apoptosis

抑郁症是一种常见的大脑功能紊乱性疾病，临床多表现为患者自主活动兴趣持续性低落，并伴随有思维缓慢、神情呆滞等症状^［1］ 。近年来，抑郁症发病率逐年攀升，至2020年全球抑郁症患者已突破3.5亿且愈加呈现年轻化趋势^［2］ 。目前抑郁症临床治疗药物多为单胺类化学药物，不仅不良反应大、服用周期长，而且还有明显的抗药性，有效治愈率普遍较低。因此，研发有效的抗抑郁中药制剂是亟待解决的问题。

本课题组前期实验研究发现温阳解郁颗粒能显著改善慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mildstress，CUMS）模型大鼠的抑郁样行为，降低高糖皮质激素水平对大脑海马组织的损伤，明显提高大鼠海马区脑源性神经营养因子、环磷腺苷效应元件结合蛋白mRNA的表达量^［3-4］ ，但温阳解郁颗粒如何抑制海马组织形态改变的相关机制还需深入探究。

下丘脑垂体肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）轴是参与认知、学习、记忆等高级生理活动的主要神经内分泌系统，抑郁症发病与HPA轴功能异常亢进有密切关系，糖皮质激素水平持续升高直接影响HPA轴调节功能。已有研究表明CUMS模型大鼠、小鼠的HPA轴功能亢进，糖皮质激素含量明显提高，持续高水平的糖皮质激素可在较短时间内抑制神经元存活，诱导其凋亡^［5-8］ 。本实验以小鼠海马神经元HT22细胞为研究对象，采用高浓度皮质酮刺激HT22细胞，模拟抑郁患者受到外界环境刺激或自身心理应激时，机体糖皮质激素持续升高导致海马神经元可塑性调节失衡，通过分析细胞形态、存活率、乳酸脱氢酶（LDH）含量、细胞凋亡率、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）/神经元核抗原（Neun）免疫荧光染色等不同指标，探讨温阳解郁颗粒对皮质酮损伤型HT22细胞的保护作用，为该制剂的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与动物

小鼠海马神经元HT22细胞（上海康朗生物科技有限公司20190811）；SPF级ICR雄性小鼠30只，18～22 g，购于北京维通利华有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0005。

1.2 实验药物与试剂

温阳解郁颗粒来源于山西省中西医结合医院药剂科。皮质酮粉末（250 mg）、氟西汀（上海毕得医药科技有限公司），CCK-8试剂盒（美国Boster公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），Brdu粉剂、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、0.25% EDTA胰蛋白酶消化液及Hoechst33258染料（北京索莱宝科技有限公司），LDH试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 主要仪器与设备

Varioskan^TM "LUX多功能酶标仪（美国Thermo公司），FACS CantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司），Galaxy 170S CO2 恒温细胞培养箱（德国Eppendorf公司），ImageXpress Micro 4共聚焦高内涵成像系统（美国Molecular Devices公司），DFAC 450C倒置显微镜（德 国Leica公司），BBS-V800型超净工作台（山东博科生物产业有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清的制备 将30只小鼠分为空白组、温阳解郁组（2.374 g/mL）和氟西汀组（0.126 mg/mL），每组10只，适应性喂养1周后，除空白组外，其余两组分别灌胃给予相应的药物（15 mL/kg），空白组灌胃等体积蒸馏水，连续给药1周。末次给药1 h后，小鼠眼球取血，3 500 r/min离心15 min，取上层血清于无菌EP管中，56 ℃水浴锅灭活30 min，经75%乙醇消毒后移入超净工作台，0.22 μm微孔滤膜分别过滤除菌后分装，-80 ℃保存，备用。

1.4.2 细胞分组、造模和给药 将HT22细胞分为正常组、模型组、温阳解郁组和氟西汀组，每组设置5个 复孔。正常组加入新鲜培养基，常规培养，不给予任何药物处理；模型组用含459.5 μmol/L皮质酮的培养液培养24 h，加入含10%空白血清培养液作用24 h；皮质酮造模完成后，温阳解郁组加入含10%温阳解郁颗粒含药血清干预24 h，氟西汀组加入含5%氟西汀含药血清干预24 h。

1.4.3 CCK-8法检测细胞存活率 给药干预24 h后，所有孔弃去旧培养基，每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育30 min，酶标仪450 nm处检测各组细胞存活率，在倒置显微镜下观察各组HT22细胞形态变化。

1.4.4 酶联免疫法检测LDH活性 将HT22细胞以5×10⁴ /mL的密度接种于6孔板中，每孔1.5 mL，以10%胎牛血清培养液培养24 h，待细胞完全贴壁后，各组HT22细胞分别按照不同分组情况进行加药处理，实验完成后收集各组细胞上清液，3 500 r/min离 心5 min，进行LDH活性比色检测。每组设置3个复孔，依序加样、混匀，室温放置5 min ，酶标仪450 nm处测定其光密度，计算细胞中LDH的释放量。

1.4.5 免疫荧光法检测Brdu、Neun荧光表达 各组细胞完成给药处理后，吸弃旧培养基，每组避光加入10 μmol/L Brdu培养液，置于培养箱内孵育40 min ，弃掉旧培养液，PBS冲洗3次。4%多聚甲醛溶液固定30 min后滴加破膜液处理10 min，PBS冲洗3次。继续滴加4%多聚甲醛处理10 min，1 mol/L "HCL 37 ℃避光处理30 min，PBS冲洗，加3%牛血清白蛋白封闭液处理1 h后，滴加Brdu抗体稀释液，4 ℃避光孵育过夜。第2天加PBS冲洗3次 ，分别滴加荧光二抗混合液，室温避光孵育1 h，弃掉二抗，加Hoechst染液染核5 min，PBS冲洗3次 ，即刻显微镜下观察。利用ImageXpress Micro高内涵成像系统随机采集各组图像，记录各组Hoechst染核、Brdu阳性细胞数以及与Neun共染细胞数，根据核内荧光强度与胞浆荧光强度的比值计算Brdu占Neun阳性细胞数的比例，评价各含药血清对海马神经元细胞分裂、分化的影响。

1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞完成给药处理后，预冷PBS冲洗2～3次，用不含EDTA的胰酶消化，收集各组细胞并计数（每组细胞数应≥ 1×10⁶ /mL），12 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1 mL 1×结合缓冲液，离心并重悬细胞。室温下分别避光加入Annexin V-FITC、PI染色液，避光孵育10 min，加PBS至500 μL，轻轻混匀，1 h内上机检测。实验设空白管、Annexin V-FITC管、PI单染管，重复3次，计算比较各组HT22细胞给药后细胞凋亡情况，并利用软件WinMDI 3.1处理分析数据与图像。

1.5 统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计分析，结合GraphPad Prism 8.0软件进行图表绘制，所有符合正态分布计量资料以均数±标准差（ x±s ）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD- t 检验， P lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 温阳解郁颗粒对皮质酮损伤型HT22细胞活力的影响

与正常组比较，模型组细胞触角大多数消失变圆，细胞数量显著减少，存活率显著降低（ t =10.10， P lt;0.01）；与模型组比较，温阳解郁组、氟西汀组细胞数目明显增多，细胞存活率均明显升高（ t =4.74， t = 5.22， P 均lt;0.05）。见图1、图2。

2.2 温阳解郁颗粒对皮质酮损伤型HT22细胞LDH含量的影响

与正常组比较，模型组LDH含量显著升高（ t =52.14， P lt;0.01）；与模型组比较，温阳解郁组、氟西汀组LDH含量明显降低（ t =39.69， t =33.45， P 均lt;0.05），见图3。

2.3 温阳解郁颗粒对皮质酮损伤型HT22细胞存活数量的影响

HT22细胞Hoechst染核结果显示，正常组细胞核被Hoechst均匀蓝染，形状规则且完整；与正常组比较，模型组活细胞数量显著减少，细胞核呈碎块状或半月形凝聚，大部分细胞甚至脱落消失；与模型组比较，温阳解郁组和氟西汀组细胞核形态近乎完整，活细胞数量均有一定程度增加。见图4。

2.4 温阳解郁颗粒对皮质酮损伤型HT22细胞Brdu、Neun表达的影响

荧光染色结果显示，正常组Brdu单染时阳性细胞单个散落或簇网状分布，呈圆形或梭形且荧光表达弱，Neun单染荧光表达强且细胞呈网状触角型，几乎80%的细胞为成熟神经元，分化完全。与正常组比较，模型组Brdu阳性细胞数明显下降（ t =8.00， P lt;0.01），Neun单染结果显示细胞形态触角回缩、触角数量明显减少，Brdu/Neun双染荧光强度显著降低（ t =6.54， P lt;0.01）；与模型组比较，温阳解郁组和氟西汀组的Brdu阳性细胞数均显著增加（ t = 31.02， t =26.94， P 均lt;0.01），Brdu/Neun双染荧光强度均增强（ t =3.03， t =3.60， P 均lt;0.05）。见图5～ 图7。

2.5 温阳解郁颗粒对皮质酮损伤型HT22细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC、PI染色结果见图8A，其中Q3象限为正常细胞，早期凋亡的细胞分布在Q4象限，坏死细胞和晚期凋亡的细胞集中在Q1、Q2象限。与正常组比较，模型组的细胞凋亡率显著升高（ t =39.56， P lt;0.01）；与模型组相比，温阳解郁组和氟西汀组细胞凋亡率均显著下降（ t =10.64， t =15.17， P 均lt;0.01），见图8B。

3 讨论

HPA轴是神经内分泌系统的重要部分，参与调控维持机体内环境平衡。HPA轴的调节主要依赖糖皮质激素。当外界环境有持续性应激刺激时，HPA轴功能发生亢进性反馈调节，过度激活糖皮质激素受体表达，引起机体系统调节紊乱，从而诱发抑郁症^［9］ 。海马是HPA轴最关键的上游脑区，也是糖皮质激素受体高表达区，更易受到糖皮质激素的影响。啮齿类动物体内主要的糖皮质激素是皮质酮^［2］ 。高水平糖皮质激素越过大脑屏障，过度结合脑海马区的皮质酮受体，造成神经系统可塑性失调，具体表现为神经元衰竭、神经胶质细胞损伤、海马神经元体积萎缩、神经突触减少等，因此海马神经元可塑性失衡可能是抑郁症发病的关键机制之一^［10］ 。HT22细胞是一种小鼠海马的永生化神经元细胞系，在神经系统疾病（如抑郁症、阿尔茨海默病等）相关研究中常被应用为体外细胞模型^［9，11］ 。本研究利用高浓度皮质酮溶液刺激HT22细胞模拟构建体外抑郁模型，评价温阳解郁颗粒对HT22皮质酮损伤型神经元细胞的保护作用。

细胞存活率是评价细胞模型、细胞状态最直观的指标，本研究结果表明，模型组中HT22细胞数量显著减少，而经温阳解郁颗粒干预后，可以明显抑制皮质酮对神经元细胞的损伤，增加神经元细胞的数量。细胞凋亡是评价细胞模型构建成功的关键因素，它可以影响细胞存活率，间接评价温阳解郁颗粒的药物效应。LDH广泛存在于神经元细胞中，反映细胞凋亡和坏死引起的细胞损伤情况。LDH的释放与细胞膜完整性密切相关，且释放量与细胞受损程度呈正相关^［12］ ，是细胞代谢的指标性成分^［13］ 。神经元细胞损伤会引起神经细胞膜功能异常，导致LDH溢出，释放到细胞培养基中。本研究表明皮质酮能一定程度抑制HT22细胞的生长，降低其存活率，经温阳解郁颗粒干预后，可以明显增加神经元细胞数量，促进受损HT22细胞神经网状触角分化增多，明显减少HT22细胞凋亡的发生，降低LDH释放量，保护受损海马神经元细胞，提高其存活率。

另外，Brdu、BrdU/NeuN是目前公认的与神经再生关系密切的实验观察指标。在细胞的复制期，Brdu渗入细胞DNA，随细胞分化进入到下一代细胞，可反映细胞增殖及经历DNA修复细胞的情况。Brdu/Neun可作为新生的成熟神经元的标志^［14-15］ 。本研究结果表明，温阳解郁颗粒可明显增加Brdu阳性细胞数，Brdu/Neun双染荧光强度增强，说明温阳解郁颗粒可一定程度上修复受损的海马神经元细胞，增强神经元细胞的增殖和分化能力，并促进生成大量的神经元细胞。

综上，温阳解郁颗粒可调控修复受损的海马神经元细胞，抑制神经元细胞凋亡，增强海马神经元突触可塑性，提高神经元细胞的存活率，保护神经元细胞，进而发挥抗抑郁作用。本研究为进一步明确温阳解郁颗粒抗抑郁的作用机制提供研究方向，同时为温阳法治疗抑郁症提供一定的参考。

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［收稿日期］ 2023-12-06" ［编辑］ 郭 欣