国产硫酸庆大霉素滴眼液中抑菌剂的使用现状分析

摘要：目的 分析国产硫酸庆大霉素滴眼液中抑菌剂使用现状及存在的问题。方法 采用新建的硫酸庆大霉素滴眼液中抑菌剂含量测定方法，结合抑菌剂影响因素试验、抑菌剂与包材的相容性对23批次国产硫酸庆大霉素滴眼液中的抑菌剂进行检测，分析该产品中抑菌剂使用的合理性。结果 硫酸庆大霉素滴眼液中羟苯乙酯的含量随产品剩余效期减少而降低，产品使用的低密度聚乙烯滴眼剂瓶对抑菌剂羟苯乙酯存在吸附作用。结论 目前国产硫酸庆大霉素滴眼液中抑菌剂羟苯乙酯的使用存在一定问题，建议企业重视处方中抑菌剂种类和含量的筛选以及抑菌剂稳定性的考察，并改进包装材料，以确保产品的安全有效。

关键词：硫酸庆大霉素滴眼液；抑菌剂；低密度聚乙烯滴眼剂瓶；羟苯乙酯

中图分类号：R917，R978.1 文献标志码：A

Analysis of antimicrobial preservative used in domestic gentamicin

sulfate eye drops

Mei Qian， Zhang Tingting， Li Yitian， Li Jie， and Liu Ying

（Henan Provincial Institute for Drug and Medical Device Control， Henan Chemical Quality Evaluation and Control Engineering Technology Research Center， Zhengzhou 450018）

Abstract Objective To investigate the current situation and analyze the existing problems with the antimicrobial preservative in domestic gentamicin sulfate eye drops. Methods In order to evaluate the rationality of the antimicrobial preservative to be added to gentamicin sulfate eye drops， 23 batches of domestic gentamicin sulfate eye drops were analyzed by a newly established quantitative method for antimicrobial preservatives. The influence factor test， compatibility of antimicrobial preservative， and packaging material were also studied. Results The content of ethyparaben in gentamicin sulfate eye drops would decrease with the reduction of residual validity periods. Besides， it was proven that ethyparaben would be absorbed by low-density polyethylene bottles for eye drops. Conclusion Some problems existed with the usage of antimicrobial preservatives， such as hydroxyphenyl ethyl ester， in domestic gentamicin sulfate eye drops. It was suggested that enterprises should pay attention to the screening type and dosage of antimicrobial preservatives， ensure the stability of preservatives， and improve packing materials so as to guarantee the safety and effectiveness of the product.

Key words Gentamicin sulfate eye drops; Antimicrobial preservatives; Low-density polyethylene bottles for eye drops; Ethyparaben

硫酸庆大霉素是一种氨基糖苷类广谱抗生素，对革兰阳性菌和革兰阴性菌都有良好的抗菌作用[1]，其滴眼液为直接用于眼部的外用多剂量无菌液体制剂，主要用于治疗结膜炎、角膜炎、眼睑炎及睑板腺炎等感染。为防止在使用过程中被微生物污染，多剂量眼用制剂一般应加适当抑菌剂[2]，但所有的抑菌剂都具有一定细胞毒性，用于人体可能产生安全性风险。目前各国都非常关注抑菌剂的安全性和有效性，国际人用药品注册技术协调会（ICH）[3]和《英国药典》[4]、《美国药典》[5]均要求测定眼用制剂中抑菌剂的含量。我国对于滴眼液中抑菌剂的控制尚不完善，缺乏使用剂量和含量的控制研究，《中国药典》2020年版二部收载了38个滴眼液品种，仅有11个列出抑菌剂含量检查，可能造成抑菌剂选择和使用不规范，存在潜在风险；其次，《中国药典》2020年版四部通则中未收载统一规范的滴眼剂常用抑菌剂的检测方法，不利于实施有效的监管[6]。

目前国内2家硫酸庆大霉素滴眼液在产企业添加的抑菌剂种类及浓度均为羟苯乙酯（0.3 mg/mL），但该品种现行标准中未收载抑菌剂检查，本研究新建HPLC法考察样品是否存在处方外违规使用抑菌剂的情况，并结合抑菌剂与包材的相容性等方面分析其抑菌剂应用的合理性。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂

e2695高效液相色谱仪（2998 PDA检测器、2489紫外检测器，美国Waters公司）；Ultimate 3000双三元液相色谱仪（美国Thermo公司）；QE plus离子轨道阱高分辨质谱仪（美国Thermo公司）； XPE205电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

色谱级甲醇、乙腈（德国Merck公司），色谱级三乙胺、乙酸（北京百灵威科技有限公司），超纯水由Millipore 纯水仪制备，其余试剂均为分析纯。

1.2 试药

标准物质：羟苯甲酯（批号100278-201906）、羟苯乙酯（批号100847-201604）、羟苯丙酯（批号100444-202005）、硫柳汞钠（批号135050-201401）、苯扎氯铵（批号100549-201805）、苯扎溴铵（批号135051-202002）均购自中国食品药品检定研究院，对羟基苯甲酸（批号LRAC5151）购自Sigma-Aldrich公司。

样品：硫酸庆大霉素原料2批次（A企业与B企业各1批次），硫酸庆大霉素滴眼液23批次（A企业17批次，B企业6批次），低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶2批次（A企业与B企业各1批次）；辅料（包括硼酸、硼砂、羟苯乙酯，各1批次）均由A企业提供。

2 试验方法及结果

2.1 抑菌剂含量测定

2.1.1 检测波长的选择

取羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞钠、苯扎氯铵和苯扎溴铵对照品溶液，采用二极管阵列检测器分别在210～400 nm进行光谱扫描，结果显示尼泊金类（羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯）均在257 nm附近有最大吸收，季铵盐类（苯扎溴铵、苯扎氯铵）在263 nm处有最大吸收，有机汞类（硫柳汞）仅有末端吸收，无最大吸收。在214 nm波长处6种抑菌剂均有较大吸收，最终选择检测波长为214 nm。

2.1.2 色谱条件

色谱柱为Waters XBridge C18（5 μm，4.6 mm× 150 mm），以1%三乙胺溶液（用磷酸调节pH值至3.05）为流动相A，甲醇为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，检测波长214 nm。

2.1.3 溶液的制备

供试品溶液：精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密称（量）取羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞钠和苯扎溴铵对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成约含羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯各6 μg/mL、硫柳汞20 μg/mL、苯扎溴铵100 μg/mL的混合溶液，作为对照品溶液（1）。另精密量取苯扎氯铵对照品适量，加水稀释制成约含苯扎氯铵100 μg/mL的溶液，作为对照品溶液（2）（因苯扎氯铵由系列同系物组成，其中n-C12H25同系物的色谱峰与苯扎溴铵峰的保留时间一致，故苯扎氯铵对照品溶液需单独配制）。

2.1.4 系统适用性试验

称（量）取羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、硫柳汞钠、苯扎氯铵和苯扎溴铵对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成约含羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯各6 μg/mL、硫柳汞20 μg/mL、苯扎溴铵和苯扎氯铵各100 μg/mL的混合溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，结果各峰之间的分离度均不小于1.5，见图1。

2.1.5 专属性试验

按制剂的处方比例分别称取硫酸庆大霉素原料与辅料（硼酸、硼砂）适量，照“2.1.3”项下供试品溶液制备方法配制，得相当于庆大霉素0.1 mg/mL的空白辅料溶液。分别精密量取空白溶剂（水）与空白辅料溶液进样，记录色谱图，见图2。结果空白溶剂与辅料均不干扰6种抑菌剂的测定。

2.1.6 线性关系考察

精密称取羟苯甲酯对照品13.18 mg、羟苯乙酯对照品11.98 mg、羟苯丙酯对照品12.23 mg，硫柳汞钠对照品10.44 mg，精密量取苯扎溴铵对照品1 mL，苯扎氯铵对照品0.8 mL，分别加水溶解并定量稀释，制成约含羟苯甲酯0.48 mg/mL、羟苯乙酯0.48 mg/mL、羟苯丙酯0.48 mg/mL、硫柳汞1 mg/mL、苯扎溴铵1 mg/mL和苯扎氯铵1 mg/mL的贮备液。精密量取上述各贮备液适量，用水定量稀释制成不同浓度的系列混合线性溶液，其中苯扎氯铵线性溶液单独配制（计算时以n-C12H25与n-C14H29同系物峰面积之和作为苯扎氯铵的峰面积），进样，记录色谱图。结果6种抑菌剂的峰面积与浓度之间的线性关系均良好，见表2。

2.1.7 检测限与定量限

精密量取“2.1.5”项下线性溶液，用水逐级稀释。以信噪比S/N约为3：1计为检测限，以信噪比S/N约为10：1为定量限，结果如表2所示。

2.1.8 精密度试验

取“2.1.2”项下对照品溶液（1）和（2），分别连续进样6针，记录色谱图，结果6种抑菌剂的峰面积RSD分别为0.3%（羟苯甲酯）、0.4%（羟苯乙酯）、0.8%（羟苯丙酯）、0.6%（硫柳汞）、0.5%（苯扎溴铵）、0.1%（苯扎氯铵），表明进样精密度良好。

2.1.9 重复性试验

取同一批次供试品（A企业，批号200802）6瓶，分别精密量取1 mL，各置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，进样并记录色谱图，结果6份供试品溶液仅检出羟苯乙酯，含量的RSD为0.8%，表明重复性良好。

2.1.10 回收率试验

按制剂的处方比例分别称取硫酸庆大霉素原料与辅料（硼酸、硼砂）适量，用水溶解并定量稀释制成约含庆大霉素0.1 mg/mL的空白辅料溶液。分别精密称（量）取6种抑菌剂对照品适量，加空白辅料溶液溶解并定量稀释，分别配制高、中、低浓度的溶液，各浓度平行配制3份。按外标法计算回收率，结果6种抑菌剂的回收率均良好，见表2。

2.1.11 稳定性试验

取硫酸庆大霉素滴眼液（A企业，批号200802），照“2.1.3”配制供试品溶液。取该供试品溶液与“2.1.3”项下对照品溶液（1）和（2）于室温放置，分别在第0、2、4、6、8和12 h时间点进样，记录色谱图，以6种抑菌剂的峰面积为指标考察两种溶液的稳定性。结果供试品溶液中羟苯乙酯峰面积RSD为0.2%，对照品溶液中各抑菌剂峰面积的RSD分别为0.3%（羟苯甲酯）、0.3%（羟苯乙酯）、0.5%（羟苯丙酯）、0.4%（硫柳汞）、0.3%（苯扎溴铵）、0.1%（苯扎氯铵），无明显变化趋势，表明各抑菌剂在室温12 h内的稳定性良好。

2.1.12 耐用性试验

取“2.1.4”项下系统适用性溶液，分别在改变色谱柱品牌、柱温、流速与流动相pH值的条件下进样，考察各抑菌剂之间的分离度，结果本方法在改变4种色谱柱品牌，柱温±5 ℃，流速±20%，流动相pH值±0.05时，各峰之间的分离度均不小于1.5，表明该方法的耐用性良好。

2.1.13 样品测定

按“2.1.3”项下的方法制备对照品溶液及供试品溶液，对2家生产企业的23批次硫酸庆大霉素滴眼液进行抑菌剂含量测定。结果2家企业样品均仅检出羟苯乙酯，与处方一致，未发现违规添加抑菌剂情况，其中A企业样品中羟苯乙酯含量为标示量（0.3 mg/mL）的88.8%～97.0%，B企业样品中羟苯乙酯含量为标示量（0.3 mg/mL）的74.6%～92.0%，见图3。

2.2 羟苯乙酯含量与产品效期相关性分析

对2家企业远、中、近/过效期共5批次（A企业3批次，B企业2批次）样品中羟苯乙酯含量测定结果分别进行分析，结果每个企业样品中羟苯乙酯的含量均随产品剩余效期的减少而降低，见图4，相关性分析显示二者存在显著正相关（双尾显著性值0.037＜0.05）。

2.3 影响因素试验

拟采用影响因素试验考察影响羟苯乙酯稳定性的因素，为制剂生产工艺、贮藏条件等制定及抑菌剂使用合理性提供依据。取2家企业各1批次样品，通过高温60 ℃（5、10和30 d取样），高湿92.5%相对湿度、25 ℃（5和10 d取样）和强光4500 Lx照射（5和10 d取样）等影响因素试验，测定其羟苯乙酯的含量。结果高湿与光照条件下，羟苯乙酯含量无明显变化，但高温条件下，随放置时间延长，A企业样品中羟苯乙酯含量由96.3%降至77.5%，B企业样品中羟苯乙酯含量由91.2%降至65.1%。

2.4 羟苯乙酯与包材相容性

据文献报道[7]，若高温加热时间较长，羟苯乙酯含量有明显降低，降解产物含量增加。为考察高温条件下，羟苯乙酯含量降低的原因是自身降解或包材吸附，模拟2家企业的处方工艺自制小样，分别灌装至其提供的低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶（以下简称“聚乙烯瓶”）中，密封，按“2.3”项下条件进行高温试验，同时以玻璃试管为对照进行平行试验，采用LC-MS法对样品进行分析，色谱柱为GL Sciences InertsilTM ODS-3（100 mm×3.0 mm，5 μm），流动相A为0.5%乙酸溶液，流动相B为乙腈，照表3梯度洗脱表进行洗脱，流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，进样量1 μL。质谱检测器，ESI源（-），喷雾电压3.5 kV，离子传输管温度350 ℃，辅助气温度350 ℃，辅助气流量10 mL/min，鞘气流量40 mL/min，扫描模式fullscan负离子模式，扫描起止时间2～10 min，扫描范围m/z：120～145。

结果高温60 ℃条件下，随放置时间延长，两种容器的自制样品中羟苯乙酯的降解产物对羟基苯甲酸含量均缓慢增加，且增加量基本一致，表明高温可使羟苯乙酯部分降解，见图5A。但玻璃试管自制样品中羟苯乙酯仅含量下降3.8%，聚乙烯瓶自制样品中羟苯乙酯含量下降29.1%，见图5B，提示高温条件下，羟苯乙酯含量降低是由自身降解和聚乙烯瓶吸附共同导致，但降解量远小于被吸附量，表明羟苯乙酯与聚乙烯瓶的相容性较差。

3 小结

由于抑菌剂存在一定的眼表毒性，其正确选择和合理使用是保证眼用制剂安全、有效性的关键。理论上抗生素滴眼液一般并不需要额外添加较高浓度的抑菌剂，但长期以来我国在药品研发、生产和检验过程中对抑菌剂使用重视不够[8]，导致普遍存在抑菌剂滥用的现象，缺乏完善的抑菌剂有效性与安全性评价。

硫酸庆大霉素滴眼液在我国上市时间为1984年，早期处方研究不充分，目前由于各方面原因导致在产企业很少，更缺乏对其处方和包材选择的合理性研究。本研究发现硫酸庆大霉素滴眼液贮存于低密度聚乙烯包装材料中，随着时间的推移抑菌剂羟苯乙酯含量会降低，并从羟苯乙酯与低密度聚乙烯瓶的相容性方面说明了该品种处方中抑菌剂使用存在一定问题，建议企业统筹考虑产品特点、抑菌作用以及稳定性等多方面因素完善抑菌剂合理使用的评价，并加强包材与抑菌剂相容性考察，改进包装材料，确保产品的安全有效。

参 考 文 献

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文章编号：1001-8689（2024）09-1019-06

收稿日期：2023-10-24

作者简介：梅芊，女，生于1986年，硕士，副主任药师，主要从事抗生素药品质量分析与质量控制，E-mail： mmqqggll@163.com

*通信作者，E-mail： ying_leaf@263. net