壳聚糖与大蒜素联用抑菌与伽师瓜抗菌贮藏研究

张强，王丹，李冠*

1(新疆大学 生命科学与技术学院,新疆 乌鲁木齐, 830046) 2(新疆农垦科学院农产品加工研究所，新疆 石河子， 832000)

甜瓜(CucumismeloL.)，1年生的草本葫芦科植物，伽师瓜是提昂的一个厚皮品种，因原产地为新疆伽师县而得名。伽师瓜汁多肉脆、香甜可口，深受人们青睐。然而，伽师瓜容易染病腐烂，难以长期贮藏保鲜[1]。目前，使用化学药物是控制甜瓜染病腐烂的主要方法，但药物残留存在食品安全隐患。因此，研究开发安全、高效的天然抗菌剂，对减少甜瓜贮藏过程中病害腐烂、延长保鲜期、减少化学药剂使用量、提高食品安全都有重要意义。

壳聚糖与大蒜素均为天然产物，安全无毒。壳聚糖是甲壳质脱乙酰后的产品，有一定的抑菌活性[2]，壳聚糖分子量从几千至几十万，研究表明，黏均分子量在1.5×105左右的壳聚糖有较强的抑菌活性[3-4]；壳聚糖还具有成膜特性[5]，目前壳聚糖已应用于抑菌保鲜膜[6]，曹雪慧等用壳聚糖涂膜对果蔬保鲜的研究表明，壳聚糖在发挥抑菌作用的同时，果蔬水分的散失亦得到减缓[7]，壳聚糖与其他物质结合使用，保鲜效果更好，李慧妍将壳聚糖与1-甲基环丙烯复配，既有抑菌效果，还能减缓果蔬的呼吸作用[8]，壳聚糖与ZnO混合能够增加膜强度与抑菌活性[9]，黄皮精油-壳聚糖复合涂膜番木瓜能显著降低瓜病情指数，延缓果实腐烂[10]。大蒜素是广谱抑菌剂，其抑菌活性很强[11]，姜绍通等在冷却肉表面涂抹大蒜素，抑菌效果显著，冷却肉的保鲜期可达19d以上[12]；王梅等用大蒜素提取液对鲜切山药进行保鲜，结果显示大蒜素能够杀菌防腐烂，并能抑制多酚氧化酶和过氧化物酶的酶活性，降低鲜切山药的呼吸强度与褐变度，减少鲜切山药的失重[13]。虽然大蒜素抗菌保鲜性能优良，但气味不佳，多用于须烹煮后熟食的肉类或蔬菜。而瓜类多有较厚的皮，如西瓜，甜瓜，大蒜素难以对瓜内的食用部分的风味产生影响。目前，将壳聚糖与大蒜素联合使用，联合抑菌剂的活性与稳定性以及对甜瓜的抗菌保鲜作用尚不明确。因此，本文以壳聚糖、大蒜素为抑菌剂，对厚皮甜瓜品种伽师瓜贮藏过程中常见的4种致腐烂病原菌[14-15]：毛霉菌(Mucormucdo)、镰饱菌(Fusariumspp.)、链格孢菌(Alternariaalternata)、青霉菌(Penicillumspp.)的抑菌活性进行了研究，并将2种抑菌剂联合使用，研究联合抑菌剂在伽师瓜贮藏过程的抗菌防腐烂作用，为甜瓜抗菌贮藏保鲜提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

壳聚糖，脱乙酰度96%，黏均分子量为1.5×105，购于上海紫一试剂厂；大蒜素制品，大蒜素质量分数为30%，购于华牧康药业；供试菌种：毛霉菌、镰饱菌、链格孢菌、青霉菌，购于上海桑戈生物科技有限公司；伽师品种甜瓜，由新疆大学生物工程研究中心提供。

1.2 仪器与设备

ZHWY-200B型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；DHP-9162型恒温培养箱，上海印溪仪器仪表有限公司；721G-100型分光光度计，上海圣科仪器设备有限公司；KK25F55TI型冰箱，三洋电器股份有限公司；LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 抑菌溶液制备

壳聚糖抑菌溶液制备：将分子量为1.5×105壳聚糖，用20 g/L醋酸溶液溶解达到饱和后，用无菌蒸馏水稀释至15 g/L，再用0.1 mol/L NaOH将溶液pH值调节至6.0[16]；

大蒜素抑菌溶液制备：参照2013年版美国国家临床实验室标准委员会(clinical and laboratory standards institute, CLSI)标准，以无菌蒸馏水为溶剂配制大蒜素的终浓度为1.435 μg/mL[17-18]。

1.3.2 菌株培养及菌悬液的制备

将菌株接种于(luria-bertani, LB)固体培养基，在37 ℃培养12～36 h，挑选单一菌落接种于LB液体培养基，于28 ℃、180 r/min培养至菌液OD值达到0.6。菌悬液的制备：将所培养的菌调至0.5麦氏比浊单位[19]。

1.3.3 抑菌活性的测定

最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)的测定：将待测菌液用微量二倍稀释法依次稀释抑菌剂溶液，再依次加入待测菌液，以无菌蒸馏水做阴性对照，重复3次，将平板置于37 ℃培养箱内培养24 h，观察结果[20]。

抑菌圈直径的测定：采用滤纸片扩散法，用十字交叉法测定抑菌圈直径[20]。

抑菌率的测定：比浊度法[21]，抑菌率计算公式如下：

(1)

式中：A600mm，600 nm波长处吸光度，ΔA600nm，单位时间内A600nm变化。

壳聚糖、大蒜素联合抑菌剂的配制及抑菌活性测定：抑菌剂同时对4种病原菌都有抑菌作用，应取4种病原菌中MIC值中最大者。壳聚糖组与大蒜素组对应的最大MIC值分别记为C1和C2。分别以C1和C2为2种抑菌物质终浓度配制联和抑菌剂溶液，测定联合抑菌剂的抑菌活性[22-23]。

1.3.4 联合抑菌剂的抑菌稳定性测定[24]

对联合抑菌剂分别做以下处理：

温度处理，分别用40、50、60、70、80、90 ℃水浴处理联合抑菌剂30 min，以20 ℃下抑菌活性作为对照；

pH值处理，将联合抑菌剂溶液分别调至pH值为3、4、5、6、7、8、9、10；

紫外光照射处理，将联合抑菌剂置于20 W的紫外灯下30 cm处分别照射20、40、60、80 min；

对抑菌剂做以上处理后，分别测定抑菌剂的抑菌圈直径与抑菌率，重复3次，取平均值。

1.3.5 在伽师瓜贮藏过程中联合抑菌剂抗菌防腐烂作用的测定[25]

联合抑菌剂对4种病原菌的抗菌防腐烂作用测定：取成熟度一致的伽师瓜样本，用60 ℃无菌水烫漂2 min，并紫外光照射10 min，再向瓜表面接入所选4种病原菌。处理组，在接入病原菌的样本表面喷涂联合抑菌剂，对照组样本不做抑菌处理，贮藏温度20 ℃，每10 d统计1次腐烂率。处理组与对照组各3个重复，每个重复10个瓜。

联合抑菌剂对样本自带与贮藏环境病原菌的抗菌防腐烂作用测定：取成熟度一致的伽师瓜，在处理组中，向瓜面均匀喷涂联合抑菌剂，对照组样本不做抗菌处理，贮藏温度20 ℃，每10 d统计1次腐烂率。处理组与对照组各3个重复，每个重复10个瓜。

腐烂率计算公式[26]：

(2)

1.4 数据处理

实验数据采用Excel统计和绘图，用SPSS 17.0软件系统进行方差分析，以p<0.05作为差异显著的标准。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖、大蒜素的MIC以及抑菌活性的测定

如表1所示，壳聚糖与大蒜素对毛霉菌、镰饱菌、链格孢菌、青霉菌均有抑菌活性，对这4种病原菌：壳聚糖的MIC分别为3.7、3.1、4.2、5.5 g/L，与MIC对应的抑菌圈直径分别4.5、5.3、3.5、3.9 mm，抑菌率分别为34.3%、39.5%、29.3%、32.8%；大蒜素的MIC分别为2.3、1.7、2.2、2.6 g/L，与MIC对应的抑菌圈直径分别12.7、15.5、14.3、14.6 mm，抑菌率分别为59.6%、63.7%、71.3%、67.6%；壳聚糖的MIC均高于大蒜素，而对应的抑菌圈直径与抑菌率则小于大蒜素(p<0.05)，由此可知，大蒜素对4种病原菌的抑菌活性均强于壳聚糖。

表1 壳聚糖、大蒜素的MIC、抑菌圈直径和抑菌率Table 1 The MIC and inhibitory zone diameters and inhibitory rate of chitosan and allicin

2.2 壳聚糖、大蒜素与联合抑菌剂的抑菌活性

由2.1结果所示，在4种病原菌中，壳聚糖对青霉菌的MIC最大，以此浓度作为壳聚糖的质量浓度(ρ1)，为5.5 g/L，同理，大蒜素对应的质量浓度(ρ2)为2.6 g/L。

2.2.1 壳聚糖、大蒜素及联合抑菌剂的抑菌圈直径

表2 ρ1浓度下壳聚糖、 ρ2浓度下大蒜素及联合 抑菌剂的抑菌圈直径Table 2 The inhibitory zone diameters of chitosan in ρ1 and allicin in ρ2 and the combined antibacterial agents

注：不同小写字母表示LSD检验在5%水平上差异显著；表3同。

2.2.2 壳聚糖、大蒜素及联合抑菌剂的抑菌率

表3 ρ1浓度下壳聚糖、 ρ2浓度下大蒜素及联合 抑菌剂的抑菌率Table 3 The inhibitory rate of chitosan in ρ1 and allicin in ρ2 and the combined antibacterial agents

以ρ1浓度壳聚糖与ρ2浓度的大蒜素配制成联合抑菌剂，由表2与表3数据可知，壳聚糖与大蒜素联用后对4种病原菌的抑菌圈直径与抑菌率均有所增加，抑菌活性有所提高(p<0.05)。

2.3 联合抑菌剂的稳定性

2.3.1 温度对联合抑菌剂抑菌活性的影响

由图1、图2可知，联合抑菌剂的抑菌活性在40 ℃下保持良好，经50 ℃处理有小幅下降，60 ℃处理后抑菌活性有显著下降(p<0.05)，在70 ～90 ℃处理后，抑菌活性下降严重(p<0.05)。

图1 温度对联合抑菌剂抑菌圈直径的影响Fig.1 The effect of temperature on the inhibitory zone diameters of combined antibacterial agents

图2 温度对联合抑菌剂抑菌率的影响Fig.2 The effect of temperature on the inhibitory rate of combined antibacterial agents

2.3.2 pH对联用抑菌剂抑菌稳定性的影响

由图3和图4分析可知，联合抑菌剂在pH值在5～8之间抑菌活性较高，因此，联合抑菌剂适于在中性pH值条件下发挥抑菌活性。

图3 pH值对联合抑菌剂抑菌圈直径的影响Fig.3 The effect of pH on the inhibitory zone diameters of combined antibacterial agents

图4 pH值对联合抑菌剂抑菌率的影响Fig.4 The effect of pH on the inhibitory rate of combined antibacterial agents

2.3.3 紫外照射对联用抑菌剂抑菌活性的影响

由图5和图6可知，随着照射时间的延长，联合抑菌剂的抑菌活性不断下降。受紫外线照射20 min内，抑菌活性只有小幅下降。

图5 紫外线照射时间对联合抑菌剂抑菌圈直径的影响Fig.5 The effect of ultraviolet light irradiation time on the inhibitory zone diameters of combined antibacterial agents

图6 紫外线照射时间对联合抑菌剂抑菌率的影响Fig.6 The effect of ultraviolet light irradiation time on the inhibitory rate of combined antibacterial agents

2.4 联合抑菌剂在伽师瓜贮藏过程中抗菌防腐烂作用

2.4.1 在伽师瓜贮藏过程中联合抑菌剂对4种病原菌的抗菌防腐烂作用

由图7可知，在50 d时，对照组腐烂率为98.5%，处理组腐烂率仅为14.3%。处理组在贮藏120 d时，腐烂率达到97.9%，对照组腐烂速度显著高于处理组(p<0.05)。

图7 伽师瓜贮藏过程中联合抑菌剂对4种病原菌的 抗菌作用Fig.7 Antibacterial effect of combined antibacterial agents on four pathogenic bacteria in the storage of Jiashi melon

2.4.2 联合抑菌剂对样本自带与贮藏环境的病原菌的抗菌防腐烂作用

由图8可知，在20 ℃下，对照组中伽师瓜未采取抗菌措施，腐烂速度较快，70 d时全部腐烂，处理组70 d时腐烂率仅为25.1%，120 d时，全部腐烂，两者差异显著(p<0.05)。

在相同的贮藏时间，图7比图8中对照组腐烂率高，这是由于图7中的所有样本都专门致腐败较强的病原菌，所以，腐烂率较高；而图8中的样本并非全部都带有致腐败病菌，且致腐败能力不确定，因而腐烂率较低。

图8 联合抑菌剂对样本自身与贮藏环境病原菌的 抗菌作用Fig.8 Antimicrobial effect of combined antibacterial agents on pathogenic bacteria which in samples of Jiashi melon and in the storage environment

3 讨论

抑菌剂的稳定性是重要的性能指标，壳聚糖热稳定性较好[31]，高温处理后仍能保持抑菌活性。大蒜素抑菌活性强，但热稳定性差，高温下抑菌活性大幅下降甚至消失[32]。高温下，大蒜素抑菌活性急剧下降，对联合抑菌剂整体的抑菌活性影响较大，壳聚糖仍能保持稳定的抑菌活性。因此，如图1与图2所示，联合抑菌剂的抑菌活性在50～70 ℃之间快速下降，在70～90 ℃之间则下降缓慢。此外，联合抑菌剂在pH值5～8之间、紫外光照射20 min后，能保持较强的抑菌活性，抑菌稳定性良好。

微生物侵染是导致甜瓜腐烂的主要原因[15]，微生物生长繁殖分为迟缓期、对数增长期、平稳期，在经历迟缓期，达到一定数量密度后进入快速增长的对数期[33]，联合抑菌剂大量杀灭样本表面病原菌，推迟病原菌进入对数增长期。在针对4种病原菌的抗菌贮藏过程中，如图7所示，对照组腐烂率上升速度较处理组快。在实际贮藏保鲜过程中，微生物复杂繁多，难以做到全部分离分析，且产地、贮藏环境等因素都会增加病原菌种类的不确定性。对伽师瓜普通样本的抗菌贮藏，结果如图8所示，20 ℃下贮藏70 d后处理组腐烂率仅为25.1%，对照组则全部腐烂。由此可知，联合抑菌剂具有广谱抑菌活性。由于联合抑菌剂组分中壳聚糖有成膜特性，能形成一层抑菌保护膜，阻止后续病原菌的侵入，进一步降低了腐烂率，延长了保鲜期[34]。因此，图7与图8的处理组样本的保鲜期均达到120 d，差异不显著。

4 结论

壳聚糖、大蒜素对伽师瓜贮藏过程中常见的致腐败病原菌均有抑菌作用，2种抑菌剂联用有更强的抑菌活性，同时，联合抑菌剂有良好的抑菌稳定性。在伽师瓜贮藏过程中使用联合抑菌剂，能够显著的降低果实腐烂率，并延长保鲜期。因此，壳聚糖-大蒜素联合抑菌剂适用于伽师瓜抗菌贮藏保鲜，对其他种类瓜果蔬菜的抗菌贮藏保鲜也有参考意义。