湖北省眼用制剂中抑菌剂的使用及控制*

邹谨霜，王茜，姜红，周茜，孙春艳

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.湖北省药品监督检验研究院，武汉 430075)

眼用制剂是指直接用于眼部发挥治疗作用的无菌制剂。微生物的污染是眼用制剂生产、贮藏、运输及使用过程中存在的主要问题。《中华人民共和国药典》2015年版四部眼用制剂项下规定“多剂量眼用制剂一般应加适当抑菌剂，尽量选用安全风险小的抑菌剂”。抑菌剂是通过干扰微生物有机体的生长、繁殖和新陈代谢发挥抑菌作用，在发挥抑菌效力的同时也会对眼组织细胞产生毒副作用，给使用者造成安全风险。因此，抑菌剂的合理应用和控制是眼用制剂质量提升的重要环节。笔者在对湖北省内眼用制剂生产企业处方和质量标准进行调研分析的基础上，选取不同企业具有代表性的品种22批，考察样品中抑菌剂的含量，分析我省眼用制剂中抑菌剂的使用和质量控制存在的问题，探讨提高抑菌剂安全性和有效性的方法，促进眼用制剂质量的提升。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(沃特世科技上海有限公司)，岛津GC-2010 PLUS气相色谱仪(岛津公司)，瑞士Mettler XP205电子天平(感量0.01 mg)，瑞士梅特勒Sevencompact pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，Milli-Q Reference超纯水仪(默克公司)。

1.2试药 苯扎溴铵溶液对照品(批号：135051-201401，含量10.90 mg·mL-1)、苯扎氯铵溶液对照品(批号：100549-201102，含量11.10 mg·mL-1)、羟苯甲酯对照品(批号：100278-201103，含量99.6%)、羟苯乙酯对照品(批号：100847-200501，含量100%)、羟苯丙酯对照品(批号：100444-201102，含量99.6%)、硫柳汞钠对照品(批号：135050-201401，含量94.6%)、三氯叔丁醇对照品(批号：100492-200301，含量100%)，以上均购自中国食品药品检定研究院；三乙胺、磷酸为分析纯，甲醇为色谱纯，超纯水。

2 方法与结果

2.1调研及结果 调研湖北省内近几年在生产的眼用制剂的处方和质量标准，重点了解处方中抑菌剂的使用种类和使用量，以及现行标准对抑菌剂的控制情况。共收集80个处方及质量标准，涉及50个品种。所使用的抑菌剂包括：①羟苯酯类，如羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯等；②季铵盐类，如苯扎溴铵、苯扎氯铵等；③有机汞类，如硫柳汞；④三氯叔丁醇和其他醇类，如苯氧乙醇。还有一个使用山梨酸作为抑菌剂。另有2个不含抑菌剂的多剂量眼用制剂，为A企业的双氯芬酸钠滴眼液(5 mL：5 mg)和F企业的眼膏剂，单剂量使用的滴眼液均不含抑菌剂。

在上述4类抑菌剂中，使用羟苯酯类抑菌剂的最多，占42.6%；其次为硫柳汞类，占29.5%；季铵盐类抑菌剂占13.1%，三氯叔丁醇和其他醇类占14.8%。从抑菌剂的使用量来看，羟苯酯类抑菌剂为0.15～0.5 mg·mL-1、硫柳汞为0.02～0.2 mg·mL-1、苯扎溴铵为0.2%～0.75%、苯扎氯铵为0.1 mg·mL-1、三氯叔丁醇为3～4 mg·mL-1、苯氧乙醇为0.3%。

50个品种质量标准中，仅有20%对抑菌剂进行控制，且有些处方使用的抑菌剂与药典所控制的抑菌剂不相同。如在《中华人民共和国药典》2015年版中，双氯芬酸钠滴眼液控制苯扎氯铵，盐酸环丙沙星滴眼液控制苯扎溴铵和羟苯乙酯，而我省产品中均使用的硫柳汞；诺氟沙星滴眼液控制羟苯甲酯和丙酯，而我省产品中为三氯叔丁醇；氧氟沙星滴眼液控制苯扎溴铵，我省产品中的抑菌剂为羟苯甲酯和羟苯丙酯，这些品种的注册标准中也未对抑菌剂进行控制。

从调研结果来看，绝大多数品种标准中对抑菌剂缺乏有效地控制。为进一步了解我省眼用制剂中抑菌剂实际使用情况，选取了省内眼用制剂生产量较大的5家企业的16个品种22批产品，分别对其中可能存在的抑菌剂进行考察分析。

2.2抑菌剂考察 分别采用反相高效液相色谱检测季铵盐类、羟苯酯类、硫柳汞抑菌剂，采用气相色谱法检测三氯叔丁醇及其他醇酚类抑菌剂，可检出三大类8种抑菌剂，具体方法如下。

2.2.1色谱条件 ①季铵盐类和羟苯酯类抑菌剂。色谱柱：Zorbax XDB C18(250 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：以1%三乙胺溶液(用磷酸调节pH值至5.0)为流动相A，以甲醇为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：214 nm。待测抑菌剂与相邻色谱峰的分离度应符合规定。

表1 季铵盐类和羟苯酯类抑菌剂梯度洗脱

Tab.1Gradientelutionprogramofquaternaryammoniumsaltsandhydroxyphenylesterbacteriostatic%

时间/min 流动相A 流动相B0505025050171090241090255050335050

②硫柳汞抑菌剂。色谱柱：Zorbax XDB C18(250 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：以1%三乙胺溶液(用磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，甲醇为流动相B，按表2进行梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：222 nm；柱温：40 ℃。硫柳汞峰与相邻色谱峰的分离度应符合规定。

表2 硫柳汞抑菌剂梯度洗脱

Tab.2Gradientelutionprogramofthimerosalbacteriostaticagent%

时间/min 流动相A 流动相B050502505017109020109020.15050275050

③三氯叔丁醇及其他醇酚类抑菌剂。色谱柱：Agilent HP-20M(25 m×0.320 mm，0.30 μm)；检测器：氢火焰离子化检测器;氮气流速：1.5 mL·min-1；进样口温度：200 ℃；检测器温度：250 ℃；程序升温：起始温度为60 ℃，保持10 min，以每分钟 20 ℃的速度升温至150 ℃，保持3 min，继续以50 ℃·min-1的速度升温至230 ℃，保持2 min。待测抑菌剂与相邻色谱峰的分离度应符合规定。

2.2.2供试品溶液及对照品溶液的制备 ①季铵盐类和羟苯酯类抑菌剂。供试品溶液的制备：精密量取供试品5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。眼用凝胶剂为精密称取供试品5 g至10 mL量瓶中，加水2 mL充分振摇使均匀分散，用甲醇定容，充分振摇后过滤即得。

混合对照品溶液的制备：精密称取苯扎氯铵对照品约11 mg，用50%甲醇溶解并稀释成0.055 mg·mL-1的溶液作为苯扎氯铵对照品溶液储备液。精密称取羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯对照品约10，16，10，10 mg，分别用50%甲醇溶解并稀释成约含羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯1，1.6，0.5，0.5 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液储备液。精密量取各对照品溶液储备液1 mL于同一个10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成与供试品溶液中抑菌剂浓度相当的溶液，作为混合对照品溶液。

精密称取苯扎溴铵对照品约10 mg，用50%甲醇溶液溶解并稀释成0.005 mg·mL-1的溶液，作为苯扎溴铵对照品溶液。

精密量取混合对照品溶液、苯扎溴铵对照品溶液和供试品溶液20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

②硫柳汞抑菌剂(避光操作)。将已有的供试品作为供试品溶液。对照品溶液的制备：精密称取硫柳汞钠对照品12.47 mg，加水溶解并稀释制成约含硫柳汞0.24，0.024，0.12，0.012 mg·mL-1的溶液。避光储存，10 h内使用。

精密量取上述对照品溶液与供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

③三氯叔丁醇及其他醇酚类抑菌剂 供试品溶液的制备：精密量取供试品溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。对照品溶液的制备：精密称取三氯叔丁醇对照品8.52 mg置于20 mL量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成与供试品溶液中抑菌剂浓度相当的对照品溶液。

精密量取对照品溶液和供试品溶液各1 μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

2.3结果 按“2.1和2.2”项方法，对5个生产企业22批眼用制剂中3个种类共25个抑菌剂进行含量测定，典型色谱图见图1～3，测定结果(以标示量计)见表3。结果显示，抑菌剂的含量为标示量33.0%～117.0%，在80%～120%范围内的有13批，低于80%的有9批，占40.9%。抑菌剂含量低于标示量80%的样品中，有2批为羟苯甲酯、2批羟苯丙酯、2批为硫柳汞、3批为苯扎溴铵。在考察的眼用制剂中仅企业B的盐酸羟苄唑滴眼液使用三氯叔丁醇为抑菌剂，其他根据抑菌剂品种分类，比较处方量及实测量，结果见图4，5。

A.混合对照品色谱图；B.苯扎溴铵对照品色谱图；1.羟苯甲酯；2.羟苯乙酯；3.羟苯丙酯；4.羟苯丁酯；5，6.苯扎氯铵；7.苯扎溴铵

图1 季铵盐类和羟苯酯类抑菌剂典型色谱图

A.chromatogram of mixed control；B.chromatogram of benzalkonium bromide reference;1.hydroxybenzyl ester；2.hydroxyphenyl ethyl ester；3.hydroxyphenylpropyl ester ;4.hydroxyphenyl butyl ketone；5, 6.benzalkonium chloride;7.benzalkonium bromide

Fig.1Typicalchromatogramofquaternaryammoniumsaltsandhydroxyphenylesterbacteriostaticagents

1.硫柳汞

Fig.2Typicalchromatogramofthimerosalbacteriostat

1.甲醇；2.三氯叔丁醇

Fig.3Typicalchromatogramofchlorobutanolbacteriostaticagent

3 讨论

3.1标准控制问题 2015年版《中华人民共和国药典》对于眼用制剂中抑菌剂在通则项下有要求，很多品种在各论项下没有控制，有些各论有控制的品种与我省产品中的防腐剂不一致。我院曾对125批省内眼用制剂进行了考察，按照法定标准检验，未发现抑菌剂不符合规定的情况。但按照通则检测分析，有40.9%低于处方量的80%。此现象应引起标准制定者和产品生产者的关注，建议从标准制定和执行上逐步解决。

3.2工艺控制问题 22批样品中，未发现含量高于处方量120%的产品，含量偏低的较多，有的含量甚至低至33.3%，这可能与企业的投料随意、生产工艺不合理、包装材料选择不合理有关。自《中华人民共和国药典》2010年版开始，要求眼用制剂按无菌制剂管理，企业更关注制剂生产中无菌的要求，可能忽略了有的抑菌剂如硫柳汞在高温下易降解的特点。由于缺乏深入的包材相容性的研究，可能存在包装材料对抑菌剂有吸附的现象。张莉等[1]对65批盐酸左氧氟沙星滴眼液抑菌剂的包材相容性进行考察，结果显示不同材质、不同来源的盐酸左氧氟沙星滴眼液包装材料对三氯叔丁醇存在不同的吸附作用。也有的品种在选择包装材料时仅注意了对主要成分的影响，忽视了有的抑菌剂如硫柳汞遇光不稳定的特点。因此，建议企业除了严格按照处方投料外，更加关注灭菌工艺和包装材料对产品质量的影响。

3.3处方合理性问题 抑菌剂的含量会影响抑菌剂的抑菌效力[2-5]，《中华人民共和国药典》2015年版(四部) 正式收载“1121抑菌效力检查法”，主要“用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定”[6]，在所调研的55个产品中，有33个抗菌药物品种，由于抗菌药物自身具有抑菌作用，因此，建议企业加强对眼用制剂抑菌效力的考察，对于抗菌药物品种的眼用制剂是否需要添加抑菌剂更需要引起重视，降低安全风险。

表3 湖北省22批眼用制剂中抑菌剂的含量测定结果

Tab.3Contentdeterminationofbacteriostaticagentsin22batchesofophthalmicpreparationsinHubeiprovince

企业编号与品种名称与批号抑菌剂处方量实测量(mg·mL-1)含量/%企业A 氧氟沙星滴眼液(160801)羟苯甲酯0.2300.17475.7羟苯丙酯0.1150.03833.0 氧氟沙星滴眼液(160803)羟苯甲酯0.2300.18178.7羟苯丙酯0.1150.04034.8企业B 阿昔洛韦滴眼液(161101)苯扎溴铵0.1000.07474.0 利巴韦林滴眼液(161102)苯扎溴铵0.1000.07474.0 盐酸林可霉素滴眼液(161203)硫柳汞钠0.2000.17386.5 阿昔洛韦滴眼液(170305)苯扎溴铵0.1000.07878.0 珍珠明目滴眼液(170530)羟苯乙酯0.5000.46993.8 氯霉素滴眼液(160907)羟苯甲酯0.2000.19296.0羟苯丙酯0.1000.09292.0 苄达赖氨酸滴眼液(161001)苯扎溴铵0.1000.08989.0 更昔洛韦滴眼液(161104)苯扎氯铵0.1200.11797.5 苄达赖氨酸滴眼液(161109)苯扎氯铵0.1200.10184.2 马来酸噻吗洛尔滴眼液(170402)羟苯乙酯0.3000.27290.7 盐酸左氧氟沙星眼用凝胶(170707)羟苯甲酯0.4000.38496.0硫柳汞钠0.0200.00945.0企业C 利巴韦林滴眼液(1609043)三氯叔丁醇4.0003.55989.0 盐酸羟苄唑滴眼液(17050404)硫柳汞钠0.0200.01785.0 复方硫酸锌霉素滴眼(17060106)羟苯乙酯0.3000.304101.3 盐酸林可霉素滴眼液(18010401)硫柳汞钠0.0200.01785.0 阿昔洛韦滴眼液(18010403)硫柳汞钠0.0200.01785.0 滴眼用利福平(18030304)硫柳汞钠0.0300.02893.3企业D 依诺沙星滴眼液(20170101)硫柳汞钠0.1500.12583.3 盐酸洛美沙星滴眼液(20180301)硫柳汞钠0.1500.07952.7企业E 更昔洛韦眼用凝胶(170304)苯扎溴铵0.0470.055117.0

美国食品药品管理局(FDA)对不同抑菌剂的最大用量规定[7]：羟苯甲酯为0.05%，羟苯乙酯为0.05%，羟苯丙酯为0.01%，硫柳汞为0.004%～0.01%，苯扎氯铵为0.25%～0.2%，三氯叔丁醇为0.2%～0.55%，山梨酸为0.1%。在本实验中，发现有的抑菌剂在不同企业同一品种中的添加量相差较大，如硫柳汞在不同企业间相隔近10倍，D企业产品的抑菌剂添加量超出上述限值。抑菌剂的选择是否合理、添加量是否合理均需要通过抑菌效力测试来确认。

A.羟苯甲酯；B.羟苯乙酯；C.羟苯丙酯；D.苯扎氯铵；E.苯扎溴铵

A.hydroxybenzyl ester；B.hydroxyphenyl ethyl ester；C.hydroxyphenyl propyl ester ；D.benzalkonium chloride;E.benzalkonium bromide

Fig.4Comparisonofprescriptionandactualmeasurementofquaternaryammoniumsaltsandhydroxyphenylesterbacteriostaticagentsintheproductsfromvariousenterprises

图5 硫柳汞抑菌剂在各企业产品中处方量与实测量比较

Fig.5Comparisonofprescriptionandactualmeasurementofthiomersalbacteriostaticagentintheproductsfromvariousenterprises

为减少对眼睛的刺激，一般产品的pH值以6～8为佳。研究显示[8]，不同眼用制剂抑菌剂最佳pH值范围：羟苯酯类为3～9.5(抑菌剂效力随pH值升高而降低)、硫柳汞为7～8、山梨酸为pH值<6.5(pH值为4.5时效力最强)、三氯叔丁醇为<5.5、苯扎氯铵为4～10(防腐效力随pH值升高而增强)。有1个企业的磺胺醋酰钠滴眼液使用的抑菌剂为山梨酸，该产品质量标准中规定的pH值范围为8～9，其合理性仍需斟酌。因此，建议根据主药、处方中其他成分及抑菌剂的理化性质，加强对抑菌剂的种类、用量、抑菌效力及安全性的研究，合理选择抑菌剂。

3.4说明书问题 药品说明书是药品安全性、有效性的重要科学依据，用以指导安全、合理用药。眼用制剂在重复开启使用的过程中，极易影响其物理、化学及微生物稳定性，进而影响安全性及有效性[9]。在这22批眼用制剂的说明书中，均只标注了适宜的贮藏条件及未开封的有效期限，未对开启后的使用期限作出说明，建议企业对开启后的眼用制剂，在不同贮藏条件、不同时段进行微生物研究，并在说明书中标注开启后的使用期限。在22批眼用制剂仅5批的说明书中标注了所含抑菌剂的种类及用量，由于抑菌剂与眼用制剂中的成分也存在配伍禁忌，建议在眼用制剂的说明书上标注抑菌剂的种类及含量，以便指导医生与患者合理用药，保障临床用药安全。