眼氨肽滴眼液中抑菌剂的含量测定及活性炭对抑菌剂的吸附性研究

覃婷婷，黄哲甦，白海娇

（天津市药品检验研究院，天津300070）

眼氨肽滴眼液（又名眼宁滴眼液、眼生素滴眼液）系由牛、羊或猪动物眼为原料，经乙醇提取等工艺后加适量的抑菌剂并经活性炭脱色除杂质等工序无菌操作制成的滴眼液。该产品含有多种氨基酸、多肽、核苷酸及钠、钾、钙、镁等微量元素，用于治疗角膜炎、视力疲劳及青少年假性近视［1-2］，临床上也用于治疗角膜上皮持续性缺损、干眼症等眼科疾病［3-5］。该产品目前为多剂量滴眼液，需要反复开瓶与空气接触，同时本品含有多种氨基酸、核酸、多肽等营养物质，容易滋生细菌，故处方中的抑菌剂对于防止微生物繁殖、保证滴眼液的正常使用具有重要意义。

尼泊金酯类（羟苯甲酯、羟苯乙酯和羟苯丙酯等）和醋酸氯己定［6-8］常被作为滴眼液的抑菌剂使用，不同企业生产的眼氨肽滴眼液中添加了0.01%～0.02%不等的羟苯甲酯、羟苯乙酯和醋酸氯己定。由于不同种类的抑菌剂会对眼晴产生刺激作用进而造成损害［9］，近年来业界对于滴眼液抑菌剂的质量控制日益重视，并对其加入量进行严格控制，如《中华人民共和国药典》（2015年版）二部收载的滴眼液制剂中有11个品种对抑菌剂含量进行控制，限度均应为处方标示量的80%～120%或不得过120%，既限制了滴眼液中抑菌剂的添加量，又要保证抑菌剂的抑菌效力。眼氨肽滴眼液质量标准收载在国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第九册中，现行标准尚未对抑菌剂进行控制，存在着较大的风险隐患。目前尚无文献报道可以同时测定尼泊金酯类和醋酸氯己定这两类抑菌剂的检测方法，因此本研究参考相关文献［10-11］建立了眼氨肽滴眼液中抑菌剂的检测方法，并对市售的2个企业共5批眼氨肽滴眼液进行了抑菌剂含量测定，并研究活性炭对抑菌剂的吸附作用，为眼氨肽滴眼液的生产改进提供了新的指导依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

羟苯甲酯（批号100278-201705，纯度100%）、羟苯乙酯（批号100847-201604，纯度99.9%）、醋酸氯己定（批号100183-201604，纯度96.3%）（中国食品药品检定研究院）；羟苯丙酯（纯度99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；活性炭（天津市华东试剂厂）；甲醇为色谱纯，三乙胺、磷酸均为市售分析纯。眼氨肽滴眼液均为市售制剂，共5批，企业1为批号160601（S1）和180201（S2），企业 2为批号161001（S3）、161102（S4）、171004（S5）。

1.2 仪 器

1260液相色谱仪（美国安捷伦公司）；XS 205十万分之一天平（瑞士梅特勒公司）；SMHS多点加热磁力搅拌器（韩国大韩科学株式会社）。

2 方法与结果

2.1 抑菌剂的测定

2.1.1 色谱条件 采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，以1%三乙胺溶液（用磷酸调节pH至3.0）为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱:0～2 min，流动相 B 50%，2～17 min，流动相B 50%→90%，17～20 min，流动相B 90%，20～20.1 min，流动相 B 90%→50%，20.1～27min，流动相B 50%。检测波长为256 nm，柱温40℃，流速1.0 mL／min，进样量20μL。

2.1.2 溶液配制

系统适用性溶液:分别精密称取羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯和醋酸氯己定对照品适量，加50%甲醇溶解并稀释制成每1 mL分别含20μg的混合溶液作为系统适用性试验溶液，取该溶液照“2.1.1”项下条件进样分析，色谱图见图1，各组分峰之间分离度均大于1.5。

对照品溶液:取羟苯甲酯和羟苯乙酯分别精密称定，加50%甲醇溶解并稀释制成每1 mL含羟苯甲酯20μg和羟苯乙酯10μg的溶液作为对照品溶液A；取醋酸氯己定精密称定，加50%甲醇溶解并稀释制成每1 mL含醋酸氯己定15μg的溶液作为对照品溶液B。

供试品溶液:取供试品直接进样分析，以外标法计算抑菌剂含量，色谱图见图1。

阴性对照溶液:取未检出抑菌剂的样品作为阴性对照溶液，色谱图见图1。

Figure 1 Chromatograms of system suitability solution（A），test solution（B）and negative control solution（C）1:Methylparaben；2:Ethylparoben；3:Chlorhexidine acetate；4:Propylparaben

2.1.3 线性关系 取羟苯甲酯、羟苯乙酯和醋酸氯己定对照品分别精密称定，用50%甲醇稀释系列梯度溶液，溶液中分别含羟苯甲酯、羟苯乙酯和醋酸氯己定0.1～80μg／mL摇匀。取上述溶液进样20μL分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。3种抑菌剂在相应浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系。2.1.4 精密度、检出限和定量限 分别取对照品溶液A和对照品溶液B连续进样5次，记录各化合物峰面积，羟苯甲酯、羟苯乙酯和醋酸氯己定的RSD分别为0.43%、0.64%和0.43%；取对照品溶液A和对照品溶液B用50%甲醇稀释一系列浓度溶液进样分析，计算各化合物的信噪比，并计算3种抑菌剂的检出限和定量限，结果见表1。2.1.5 重复性和回收率 分别取S1和S3的同批样品各6瓶，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析测定计算各抑菌剂含量及RSD，结果见表2。取S1和S3各9份样品，每份分别精密加入相当于样品中抑菌剂含量80%、100%、120%的对照品，制备低、中、高3种浓度的溶液进样测定，计算各抑菌剂的平均回收率，结果见表2。

Table 1 Standard curves，LOQ，LOD of three bacteriostatics（n＝10）

Table 2 Results of repeatability and recovery test

2.1.6 样品测定 取收集到的5批眼氨肽滴眼液照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析测定各抑菌剂含量，结果见表3。

2.2 活性炭对抑菌剂的吸附试验

取羟苯甲酯、羟苯乙酯和醋酸氯己定分别精密称定，加50%甲醇溶解并稀释制成每1 mL含羟苯甲酯5 mg、羟苯乙酯2.5 mg和醋酸氯己定3.75 mg的抑菌剂贮备液，精密量取上述抑菌剂贮备液适量置同一量瓶中，加活性炭适量，用不含抑菌剂的供试品S3稀释制成每1 mL溶液中含羟苯甲酯0.2 mg、羟苯乙酯0.1 mg和醋酸氯己定0.15 mg的抑菌剂溶液进行以下试验。

Table 3 Bacteriostatic detected in different samples of ocular extractives eye drops

2.2.1 搅拌时间影响试验 制备活性炭含量为0.2%的抑菌剂溶液分别在室温、40℃、60℃3个不同温度下搅拌上述抑菌剂溶液，并分别在15、30、45、60 min取溶液过滤，照“2.1.2”项下方法测定3种抑菌剂的剩余百分含量，结果见图2。由图2可知，在不同温度下，羟苯甲酯和羟苯乙酯在15 min时含量均低于初始加样量的15%，而醋酸氯己定则被完全吸附，15 min后活性炭的吸附作用趋于稳定。同时在不同温度下，活性炭对抑菌剂的吸附存在差异。

Figure 2 Effect of activated carbon on adsorption of methylparaben（A）and ethylparoben（B）under different stirring time（x¯±s，n＝3）

2.2.2 加热温度影响试验 考虑到眼氨肽滴眼液实际生产时，加活性炭搅拌保温的时间一般不少于15 min，故选择30 min作为搅拌停止时间，考察在不同温度时活性炭对抑菌剂的吸附影响。制备活性炭含量为0.2%的抑菌剂溶液分别在40℃、60℃、80℃3个不同温度下搅拌上述溶液，并在30 min时取溶液过滤，照“2.1.2”项下方法测定3种抑菌剂的剩余百分含量，结果在不同温度下醋酸氯己定均被完全吸附，而对于羟苯甲酯和羟苯乙酯，温度越低，则抑菌剂剩余量越少，活性炭对抑菌剂的吸附能力越强，见图3。

2.2.3 活性炭浓度影响试验 分别制备活性炭含量为0.1%、0.2%、0.3%的抑菌剂溶液。在80℃下搅拌上述溶液，并在30 min时取溶液过滤，照“2.1.2”项下方法测定3种抑菌剂的剩余百分含量，结果醋酸氯己定仍被完全吸附，羟苯甲酯和羟苯乙酯被部分吸附，剩余百分含量见图4。由图4可知，活性炭添加量越多，抑菌剂被吸附的量越多，其中活性炭添加量为0.1%时，抑菌剂剩余量最高。

Figure 3 Effect of activated carbon on the adsorption of bacteriostat at different temperatures（x¯±s，n＝3）

Figure4 Effect of different amounts of activated carbon on the adsorption of bacteriostat（x¯±s，n＝3）

2.2.4 抑菌剂剂量影响试验 分别精密量取“2.2”项下方法抑菌剂贮备液适量，加供试品S3稀释制得含抑菌剂为处方量的100%、200%、300%的抑菌剂溶液，活性炭添加量均为0.2%。在80℃下搅拌上述溶液，并在30 min时取溶液过滤，照“2.1.2”项下方法测定3种抑菌剂的剩余百分含量，结果见图5。由图5可知，活性炭添加量为0.2%时，当抑菌剂添加量分别增至处方量的200%和300%，剩余的羟苯甲酯和羟苯乙酯才能接近处方量，而即使将抑菌剂添加至处方量的300%，经吸附后，醋酸氯己定仅剩下处方量的4.0%，抑菌剂添加量为处方量的100%和200%时，醋酸氯己定剩余量均为0%。

Figure 5 Effect of activated carbon on the adsorption of different concentrations of bacteriostat（x¯±s，n＝3）

3 讨 论

3.1 流动相的选择

参考文献［10］试验流动相为0.02 mol／L磷酸二氢钾（用磷酸调节pH至2.5）-乙腈（70∶30）时，羟苯甲酯与醋酸氯己定同时洗脱，无法有效分离。另参考文献［11］分别考察了羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯和醋酸氯己定的峰形与分离度，发现当流动相为1%三乙胺溶液（用磷酸调节pH至5.0）时醋酸氯己定峰有拖尾现象，而将该流动相用磷酸调节pH至3.0时，醋酸氯己定峰对称性较好。故最终选择流动相为以1%三乙胺溶液（用磷酸调节pH至3.0）为流动相A，甲醇为流动相B进行梯度洗脱，既保证3种抑菌剂能够完全分开，又使色谱峰具有良好的对称性。

3.2 活性炭对抑菌剂的吸附影响

本研究发现活性炭对羟苯甲酯、羟苯乙酯和醋酸氯己定3种抑菌剂的吸附能力由大到小分别为:醋酸氯己定、羟苯乙酯、羟苯甲酯，与眼氨肽滴眼液样品抑菌剂测定结果相一致，即抑菌剂含量由小到大依次为:醋酸氯己定、羟苯乙酯、羟苯甲酯。由此可见，在生产眼氨肽滴眼液时，不适宜在使用活性炭过滤杂质前添加尼泊金酯类和醋酸氯己定抑菌剂，该操作将导致抑菌剂被大量吸附，而这一现象在眼氨肽注射液的生产中尚未为人们所认知。此外，本实验为方便操作，将3种抑菌剂放在同一溶液中进行影响因素试验，在实际生产中，眼氨肽滴眼液产品只添加一种或者两种抑菌剂，被活性炭吸附后抑菌剂的剩余量可能会更少。另外，有文献报道当活性炭浓度为0.5%，在85℃保温30 min时活性炭去除眼氨肽中的杂蛋白效果最好［12］，然而该条件下，大部分抑菌剂已被活性炭吸附。综上所述，建议在眼氨肽滴眼液的生产中抑菌剂应在活性炭除杂后添加，或者选择其他对抑菌剂吸附性小、影响小的过滤介质或除杂工艺。如必须在添加抑菌剂前使用活性炭吸附除杂，因则应综合考虑活性炭对杂蛋白、主成分和抑菌剂的吸附影响，选择活性炭吸附率低的抑菌剂或调整抑菌剂的添加量，并检测终产品中抑菌剂的含量，使抑菌剂维持合理有效的浓度，保证产品的抑菌效力和质量安全。

3.3 眼氨肽滴眼液中抑菌剂的测定结果

本试验仅对市售的两个企业生产的5批眼氨肽制剂进行了抑菌剂含量测定，其结果均低于处方量的10%，未达到《中华人民共和国药典》中其他品种抑菌剂应为处方量80%～120%的限度要求，说明这两个企业的眼氨肽滴眼液质量仍有待提升，同时，应进一步建立眼氨肽滴眼液的抑菌剂测定标准，从而保证该品种的产品质量。