二氮嗪对冠心病大鼠心肌细胞凋亡及炎症反应的影响及作用机制研究

摘要" 目的： 探讨线粒体三磷酸腺苷（ATP）敏感性钾离子通道（mito-KATP）开放剂二氮嗪对冠心病大鼠心肌细胞凋亡及炎症反应的影响及作用机制。方法：SD大鼠构建冠心病模型后分为模型组、二氮嗪低剂量组、二氮嗪中剂量组、二氮嗪高剂量组，正常大鼠作为空白对照组，二氮嗪低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠分别灌胃给予二氮嗪3、5、7 mg/kg，治疗14 d后检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）水平。苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠心肌组织损伤。蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测心肌组织Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、核因子-κB（NF-κB）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR γ）相对表达水平。结果：与模型组比较，二氮嗪低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6、TG、TC、LDL-C、HDL-C、HMGR水平明显降低，心肌细胞损伤明显减少，并且凋亡相关蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达下调，Bcl-2表达明显上调，p-NF-κB表达明显降低，PPARγ表达明显上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：二氮嗪可明显缓解冠心病大鼠心肌损伤，其机制可能与调控PPARγ和NF-κB信号通路有关。

关键词" 冠心病；二氮嗪；心肌细胞凋亡；炎症反应；血脂；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.19.011

Effect of Diazoxide on Myocardial Cell Apoptosis and Inflammatory Response in Rats with Coronary Heart Disease and Its Mechanism

XIE Yuxia， WU Gang， LIANG Cheng， LIU Wenning， WANG Xinbin

Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， Xinjiang， China

Corresponding Author" WU Gang， E-mail： 15545959@qq.com

Abstract" Objective：To investigate the effect of" diazoxide on cardiomyocyte apoptosis and inflammatory response in rats with coronary heart disease（CHD）.Methods：SD rats were divided into model group，diazoxide low-dose group，diazoxide medium-dose group，and diazoxide high-dose group.Normal rats served as the blank control group，and the rats in diazoxide low-dose group，medium-dose group，high-dose group were administered 3，5，and 7 mg/kg of diazoxide by gavage respectively.After 14 days of treatment，serum levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin（IL）-1β，IL-6，triglyceride（TG），total cholesterol（TC），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C），and 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase （HMGR） were measured.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe myocardial tissue injury.Western Blot was used to detect Bax，Cleaved Caspase-3，Bcl-2， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH），nuclear factor-κB（NF-κB）， phosphorylated NF-κB（p-NF-κB），peroxisome proliferator-activated receptor γ （PPARγ）.Results：Compared with the model group， the serum levels of IL-1β，IL-6，TG，TC， LDL-C，HDL-C，and HMGR were significantly lower in the diazoxide low-dose group，middle dose group，and high-dose group.Additionally，myocardial cell damage was significantly reduced and the expression of apoptosis-related proteins Bax and Cleaved Caspase-3 was down-regulated.The expression of Bcl-2 was significantly up-regulated while the expression of p-NF-κB was significantly decreased. Furthermore，the expression of PPARγ was significantly up-regulated（P＜0.05）.Conclusion：Diazoxide can significantly alleviate myocardial injury in CHD rats，and its mechanism may relate the regulation of PPAR γ and NF- κ B signal pathway.

Keywords" coronary heart disease; diazoxide; myocardial apoptosis; inflammatory response; blood lipid; experimental study

冠心病（coronary artery heart disease）是一类冠

基金项目" 新疆医科大学附属中医医院院级课题（No.ZYY2019ZD03）

作者单位" 新疆医科大学附属中医医院（乌鲁木齐 830000）

通讯作者" 武刚，E-mail：15545959@qq.com

引用信息" 谢玉霞，武刚，梁铖，等.二氮嗪对冠心病大鼠心肌细胞凋亡及炎症反应的影响及作用机制研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（19）：3524-3528.

状动脉发生器质性或功能性病变而引起的心脏疾病，多发病于中老年人群，但是近年来其发病率逐渐年轻化［1］。冠心病的发病机制复杂，研究表明，其病理进程主要与心肌细胞凋亡、炎症、纤维化、氧化应激等密切相关，抑制心肌细胞的凋亡和心肌组织炎症可缓解冠心病的病理进程［2-3］。线粒体三磷酸腺苷（ATP）敏感性钾离子通道（mitochondrial ATP sensitive potassium channels，mito-KATP）多表达于平滑肌的细胞膜，在脏器和血管分布广泛，通过感受胞内ATP的浓度而调控钾离子的流动［4-5］。二氮嗪是mito-KATP的一种，能够有效调控心肌缺血再灌注损伤［6］，但其对冠心病心肌组织的影响及机制研究尚不完善，本研究探讨二氮嗪对冠心病大鼠心肌组织凋亡及炎症的影响，旨在为mito-KATP的临床应用及研究提供帮助。

1" 材料与方法

1.1" 材料

6周龄无特定病原体（SPF）级SD雌性大鼠30只，体质量（200±20）g，购自浙江省动物实验中心；高脂饲料购自江苏美迪森生物医药有限公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；垂体后叶素购自上海源叶生物科技有限公司；Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、核因子-κB（NF-κB）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR γ）抗体、山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2" 实验动物分组与给药

将SD大鼠分为空白对照组、模型组、二氮嗪低剂量组、二氮嗪中剂量组、二氮嗪高剂量组，每组6只，模型组、二氮嗪低剂量组、二氮嗪中剂量组、二氮嗪高剂量组大鼠连续6周给予高脂饮食喂养后，以30 μg/kg的剂量注射垂体后叶素，连续注射3 d，构建冠心病模型。造模后，二氮嗪低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠以3、5、7 mg/kg的剂量灌胃给予二氮嗪，每天给药1次，给药14 d。空白对照组、模型组灌胃生理盐水。

1.3" 大鼠血清炎性因子及血脂水平检测

给药结束后解剖大鼠，每只大鼠腹主动脉取血约7 mL于抗凝管中，然后将抗凝管室温条件下静置4 h，以3 000 r/min离心15 min，收集血清。使用生化分析仪检测血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）水平。根据ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.4" 病理检测

解剖取大鼠的心脏，于无菌培养皿中将心脏冲洗干净，按压挤出组织中的血液，然后距心尖2 mm 处横向切开，取2 mm宽的组织用4%多聚甲醛固定24 h，然后进行石蜡包埋盒切片，切片分别进行脱蜡、苏木精染色细胞核、伊红染色细胞质、脱水封片，显微镜下观察。

1.5" 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测凋亡相关蛋白及NF-κB信号通路的激活

取大鼠心肌组织50 mg，加入500 μL的RIPA蛋白裂解液，研磨均匀，冰上裂解30 min，然后4 ℃，12 000 r/min离心10 min。取蛋白10 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转膜后用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜与Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、PPARγ、p-NF-κB、NF-κB抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后，与山羊抗兔IgG抗体共孵育1.5 h，使用增强化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒曝光并拍照，使用Image J软件进行定量分析。

1.6" 统计学处理

采用GraphPad prism 7 进行统计分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2" 结" 果

2.1" 各组大鼠心肌组织损伤比较

空白对照组心肌纤维排列整齐，心肌细胞形态规则，可见横纹。模型组心肌纤维排列紊乱，间隙增宽，部分组织结构不清，心肌细胞水肿，可见较多核固缩，间质出血，较多炎细胞散在或灶状浸润。与模型组比较，二氮嗪低剂量组、中剂量组、高剂量组心肌纤维紊乱程度降低，细胞水肿及退变程度减轻，间质炎细胞浸润数量减少；二氮嗪高剂量组心肌病变改善情况优于二氮嗪中剂量组、低剂量组。详见图1。

2.2" 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6水平明显增加（P＜0.05），TNF-α水平升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，二氮嗪中剂量、高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6水平明显降低（P＜0.05），TNF-α水平无明显变化（P＞0.05）。详见表1。

2.3" 各组大鼠血脂及HMGR水平比较

模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、HMGR水平明显高于空白对照组（P＜0.05），说明冠心病大鼠体内脂代谢异常。二氮嗪低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、HMGR水平明显低于模型组（P＜0.05），说明二氮嗪可缓解冠心病大鼠体内血脂水平异常。详见表2。

2.4" 各组心肌组织中凋亡相关蛋白表达水平比较

与空白对照组比较，模型组大鼠心肌组织Bax、Cleaved Caspase-3相对表达量明显增加（P＜0.05），Bcl-2表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，二氮嗪低剂量组、中剂量组、高剂量组Bax、Cleaved Caspase-3相对表达量明显降低（P＜0.05），Bcl-2表达明显升高（P＜0.05）。说明二氮嗪可缓解冠心病大鼠心肌细胞凋亡。详见图2、表3。

2.5" 各组大鼠心肌组织PPARγ表达和NF-κB磷酸化水平比较

与空白对照组比较，模型组大鼠心肌组织中PPARγ蛋白表达明显降低（P＜0.05），p-NF-κB表达明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，二氮嗪低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠心肌组织PPARγ蛋白表达明显增加（P＜0.05），NF-κB磷酸化水平均明显降低（P＜0.05）。说明二氮嗪可调控心肌细胞PPARγ和NF-κB信号通路。详见图3、表4。

3" 讨" 论

冠心病一类缺血性心肌疾病，为冠状动脉粥样硬化所引起的血管堵塞或狭窄，进而导致心肌供血不足和缺氧，受遗传、环境、压力等多种因素的影响，冠心病近年来的发病率不断年轻化，虽然临床上冠心病能够得到有效的控制，但是不能根治，中老年病人死亡率高。冠心病的发病与心肌细胞的凋亡、炎症、自噬等相关［7-9］。Li等［10］研究表明，抑制血管内皮细胞凋亡可缓解冠心病的发生发展。有研究指出，全身炎症指标可预测冠心病病人冠状动脉狭窄的严重程度［11］。Antonopoulos等［12］研究表明，血管炎症标志物可作为心血管疾病预后的评价指标。调控心肌细胞凋亡和炎症反应有助于缓解冠心病的发生发展，本研究使用高脂饮食联合垂体后叶素构建了冠心病大鼠模型进行研究。

mito-KATP是一类存在于血管和平滑肌表面的钾离子通道，该通道的开放受胞内ATP调控，mito-KATP开放可激活心肌细胞的保护机制，调控胞内线粒体代谢和损伤，为心肌细胞的代谢提供能量［13］。二氮嗪是mito-KATP的一种，Velez等［14］研究表明，二氮嗪可明显缓解猪局部心肌缺血模型的心肌损害。Chen等［15］研究表明，二氮嗪可通过激活低氧诱导因子-1（HIF-1）/缺氧反应元件（HRE）信号通路而诱导缺氧/再氧合心肌细胞的心肌保护。本研究发现，冠心病大鼠灌胃给予二氮嗪后心肌组织病变明显缓解，说明二氮嗪能够有效缓解冠心病症状。 Zhang等［16］研究表明，TC、TG、LDL-C水平异常与不良心血管事件的发生密切相关。本研究发现，给予二氮嗪后，冠心病大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、HMGR水平明显降低，说明mito-KATP开放剂可缓解冠心病大鼠血脂异常。PPARγ信号通路是参与调控血脂代谢和葡萄糖代谢的关键信号通路，本研究发现，二氮嗪干预后冠心病大鼠心肌组织PPARγ表达明显下调，说明二氮嗪可通过调控PPARγ通路而影响血脂代谢。在细胞凋亡检测中，二氮嗪治疗后，冠心病大鼠心肌细胞凋亡数明显减少，促凋亡相关蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达明显下调，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达明显增加，细7胞凋亡缓解。Jing等［17］研究表明，诱导内皮细胞凋亡可促进冠心病的病理进程。Yang等［18］研究表明，多酚I通过调节脂质代谢和心肌细胞凋亡改善冠心病心肌损伤。

炎症反应与冠心病的发生发展密切相关，多种炎性因子调控冠心病的病理进程，其中，IL-1β和IL-6能够促进动脉斑块的生成进而发生血栓，冠心病引发的高血脂又可诱导IL-1β的生成，TNF-α 可使黏附分子释放促进斑块形成［19-20］，因此，IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子被认为是冠心病治疗的重要靶点。本研究亦发现二氮嗪治疗后冠心病大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α浓度下降，炎症相关通路NF-κB信号通路被明显抑制，说明二氮嗪可通过抑制NF-κB信号通路缓解冠心病大鼠体内炎症反应。

综上所述，mito-KATP开放剂二氮嗪可明显缓解心肌细胞凋亡以及全身的炎症反应，从而缓解冠心病大鼠心肌损伤，其机制与PPARγ通路和NF-κB通路相关。

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（收稿日期：2023-04-26）

（本文编辑郭怀印）