核桃青皮提取物对苹果斑点落叶病菌抑菌活性研究

摘" 要：【目的】采用不同提取剂提取核桃果实青皮，研究核桃青皮提取物对苹果斑点落叶病菌的抑菌活性，为核桃青皮资源的再利用提供理论支持。【方法】以苹果为试验材料，选用不同浓度梯度（25%、50%、75%、100%）的不同溶剂（乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇）对果实成熟期的核桃青皮进行浸提，测定核桃青皮提取物对苹果斑点落叶病菌生长的影响。【结果】结果表明，在离体抑菌试验中，使用浓度为0.625、1.25、2.5、5、10 mL/L的核桃青皮提取物均对苹果斑点落叶病菌表现出抑菌效果，以50%甲醇提取物在浓度为5 mL/L时的抑制效果最显著，抑制率高达80.71%，EC50值为0.001 643 6。【结论】试验可为核桃青皮提取物防治苹果斑点落叶病菌研究提供依据，为核桃青皮资源的再利用提供理论支持。

关键词：苹果斑点落叶病菌；核桃青皮提取物；抑菌

文章编号：2096-8108（2024）06-0034-05" 中图分类号：S661.1中图分类号" 文献标识码：A文献标志码

收稿日期：2024-05-07

基金项目：2024年度河北省湿地保护与绿色发展协同创新中心专项课题（2024XTCX001）

第一作者简介：高小宽（1981-），女，讲师，主要从事植物病理学研究。

Study on The Antibacterial Activity of The Extracts from Walnut Green Husk Against Apple Alternaria Blotch

GAO" Xiaokuan，ZHAO" Dan，MA" Guang，LI" Miao

（College of Life Sciences， Hengshui University， Hengshui Hebei 053000，China）

Abstract：【Objective】The green husk of walnut fruit was extracted with different extractants. The antibacterial activity of the extract of the walnut green husk against apple Alternaria Blotch was studied. It provides theoretical support for the reuse of walnut husk resources.【Methods】Four different concentration gradients of ethanol， ethyl acetate， petroleum ether and methanol （25%， 50%， 75%， 100%） were used to extract the green husk of Walnut in fructescence. The effect of walnut green husk extract on the growth of alternaria Mali were studied. 【Results】The results showed that the extracts of walnut green husk （0.062 5 mL/100 mL， 0.125 mL/100 mL， 0.25 mL/100 mL， 0.5 mL/100 mL， 1 mL/100 mL） were effective against alternaria Mali in vitro， in particular， 50% methanol extract of walnut green husk， the most significant inhibition of hypha growth， inhibition rate of 80.71%， EC50 value of 0.001 643 6.【Conclusion】The experiment can provide a basis for the research on the prevention and control of apple spotted defoliation by walnut green husk extract， and provide theoretical support for the reuse of walnut green husk resources.

Keywords：apple alternaria blotch; walnut green husk extract; antibacterial effect

苹果斑点落叶病（Alternaria alternata f.sp.mali）由苹果链格孢的强毒株系感染所引起，病原性很强，是影响产量和质量的常见苹果病害［1］。防治方法目前有栽培管理法和药物防治法，但药物防治法需注意病菌的抗药性。故研究人员开始进行生物防治法研究，如利用各种不同植物的提取物对病菌进行处理，比较其抑制率。核桃（Juglans regia L.），别称胡桃、羌桃等，为胡桃科核桃属多年生落叶乔木［2］ 。中国核桃产量近年来稳中有升，核桃青皮是核桃收获中产生的农林废料，存量巨大。核桃果实采收后，其作为废料堆放在田间地头，不断污染环境，危害动植物生存，对生态环境造成破坏［3-4］。本试验分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇为提取液提取果实成熟期的核桃青皮，获取不同浓度的核桃青皮提取物，通过抑菌活性测定，找到本试验中抑菌活性最佳的提取试剂及其浓度，为核桃青皮提取物防治苹果斑点落叶病菌研究提供依据，为核桃青皮资源的再利用提供理论支持。

1" 材料和方法

1.1" 试验材料

供试核桃：从河北昌黎选取10～20株健壮无病害的野生核桃树，8月底从每株树上选取10个健康无病害的核桃备用。然后用青皮提取物对梨黑斑病原菌进行抑菌试验。

供试病菌：在衡水旧城村苹果园中采集患苹果贮藏期斑点落叶病果实，贮藏15d后分离患病组织中的病原菌并进行纯化，获得苹果斑点落叶病菌，在4℃下保存。

1.2" 试验方法

1.2.1" 核桃青皮提取物的制备

将果实成熟期的核桃青皮烘干、粉粹、过100目筛，制成核桃青皮粉末。

设置25%、50%、75%、100% 4个提取剂浓度梯度。乙醇、甲醇和乙酸乙酯提取物料液比为1∶10，称取核桃青皮粉末10g加入定容好的有机溶剂中，25℃摇床8h，4层纱布滤去残差得到核桃青皮提取液并浓缩至10mL，4℃存放备用；石油醚提取物制备：采用索氏提取法提取，所用仪器为索氏提取器，料液比为1∶10，在索氏提取器中浸提8h，获得提取物，加入石油醚，定容至100mL，4℃保存备用。

1.2.2" 病原菌的分离、纯化和鉴定

参照方中达［5］方法。用70%酒精擦拭病果表面，无菌水冲洗干净后，切取一小块染病组织，在超净工作台中移到PDA培养基上，于25℃保温培养，待长出分生孢子后进行单孢分离，纯化后在PDA培养基上保存待用。各菌株在PDA培养基上活化培养至菌落直径接近2/3培养皿直径时，用打孔器在菌落边缘打取直径 5 mm的菌饼。

1.2.3" PDA培养基制备

参照方中达［5］方法进行。首先用天平称量去皮的马铃薯200g，将其切成小方形块，放入锅中，加无菌水1000 mL，煮沸30min。用纱布滤去马铃薯残渣，将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂15～20g，加热熔化加入葡萄糖20g。待葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1 000mL。分装后，在0.103MPa、121℃下，高压蒸气灭菌20min。

1.3" 对菌丝生长的抑制活性测定

在无菌条件下，从母液分别量取0.0625、0.125、0.25、0.5、1mL核桃青皮提取物加入100 mL的PDA培养基中，摇匀后趁热倒入直径90mm的培养皿内。灭菌后用直径为6mm打孔器在菌落边沿处钻取适量菌龄相同的菌饼，接种于含有杀菌剂的PDA培养基的中央，菌丝面向下，每皿接种1个菌饼，同等浓度做3次重复试验。25℃光照培养箱培养6d，用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径。以不加核桃青皮提取物作为对照（CK），计算菌丝生长的抑制率。

菌丝生长抑制率（%）=［（对照菌落直径-处理菌落直径）］/对照菌落直径×100%

1.4" 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件处理，以药剂质量浓度的对数为横坐标、抑制率几率值为纵坐标作图，得到毒力回归方程和有效抑制中浓度（EC50）值。

2" 结果分析

2.1" 果实成熟期核桃青皮乙醇提取物抑菌效果

由表1可知，25%乙醇提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现升高—降低—升高的趋势。其中，提取物浓度在10mL/L时抑制率最高，为54.61%。

50%乙醇提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现降低-升高—降低—升高的趋势。其中，提取物浓度在10 mL/L时抑制率最高，为62.70%。

75%乙醇提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现逐渐升高的现象。其中提取物浓度为10 mL/L时抑制率最高，为75.18%。

100%乙醇提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现逐渐降低后升高的现象。其中，提取物浓度为10mL/L时抑制率最高，为80.14%。

由上述可得，100%核桃青皮乙醇提取物在浓度为10mL/L时抑制率最高，为80.14%。

由表2可知，4种不同浓度的核桃青皮乙醇提取物对苹果斑点落叶病菌的毒力回归方程的相关系数均超过0.9000，说明试验具备较高的精密度。由各浓度的EC50值可知，100%浓度的核桃青皮乙醇提取物抑菌效果最好，毒力最强，值为1 076.918，相关系数为0.9996762。

综上所述，在S4期核桃青皮乙醇提取物中，100%浓度的核桃青皮乙醇提取物抗菌效果最佳，毒力最强，最高抑制率为80.14%，EC50值为1 076.918。

2.2" 果实成熟期核桃青皮乙酸乙酯提取物抑菌效果

表3中，25%乙酸乙酯提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现先升高后降低又升高的现象。其中，浓度为0.625mL/L时抑制率最高。

50%乙酸乙酯提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现先升高后降低的现象，其中浓度为1.25mL/L时抑制率最高。

75%乙酸乙酯提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现逐渐降低的现象，其中浓度为10mL/L时抑制率最高。

100%乙酸乙酯提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现先降低后升高又降低的现象。其中，浓度为2.5mL/L时抑制率最高。

由上述可得，50%核桃青皮乙酸乙酯提取物在1.25mL/L浓度时表现为抗菌效果最佳，值为62.41%。

表4显示，50%、75%、100% 3个浓度乙酸乙酯提取物对苹果斑点落叶病菌的毒力回归方程的相关系数高于0.9000，说明该试验具有较高的精密度。因25%浓度乙酸乙酯提取物相关系数低于0.9000，所以该数据不符合实际。由除25%浓度以外各浓度的EC50值可知，50%浓度的核桃青皮乙酸乙酯提取物抑菌效果最好，毒力最强，值为2 047.5，相关系数为0.9998083。

综上所述，在果实成熟期核桃青皮乙酸乙酯提取物中，50%浓度核桃青皮乙酸乙酯提取物抑菌效果最好，毒力最强，最高抑制率为62.41%，EC50值为2 047.5。

2.3" 果实成熟期核桃青皮石油醚提取物抑菌效果

表5中，25%石油醚提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现降低的趋势。其中，浓度为0.625mL/L时抑制率最高。

50%石油醚提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度增加呈现降低升高的趋势，其中，浓度为0.625mL/L时抑制率最高。

75%、100%石油醚提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率均随着提取物浓度的增加呈现降低现象，其中浓度为0.625mL/L时抑制率最高。

100%石油醚提取物在0.625mL/L浓度时表现为抗菌作用最佳，值为16.74%。

表6显示，25%、50%、75%、100% 4个浓度石油醚提取物对苹果斑点落叶病菌的毒力回归方程的相关系数高于0.9000，说明该试验具有较高的精密度。100%浓度的核桃青皮石油醚提取物抑菌效果最好，毒力最强，EC50值为211095.75，相关系数为0.9823391。

综上所述，在果实成熟期核桃青皮石油醚提取物中，100%浓度的核桃青皮石油醚提取物抑菌效果最好，毒力最强，最高抑制率为16.74%，EC50值为211 095.75。

2.4" 果实成熟期核桃青皮甲醇提取物抑菌效果

由表7可得，25%核桃青皮甲醇提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现先降低后升高又降低的现象。其中，浓度为1.25mL/L时抑制率最高。

50%核桃青皮甲醇提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现先升高后降低的现象，其中浓度为5mL/L时抑制率最。

75%、100%核桃青皮甲醇提取物对苹果斑点落叶病菌的抑制率随着提取物浓度的增加呈现升高又降低再升高的现象。其中浓度为10、1.25 mL/L时抑制率最高。

50%甲醇提取物在浓度为5 mL/L时抑制率最高，为80.71%。

表8显示，4种不同浓度核桃青皮甲醇提取物对苹果斑点落叶病菌的毒力回归方程的相关系数高于0.9000，说明该试验具有较高的精密度。50%浓度的核桃青皮甲醇提取物具有最佳的抑菌效果，毒力最强，值为0.016 436，相关系数为0.9994490。

表8" 核桃青皮甲醇提取物对苹果斑点落叶病菌的室内毒力测定

甲醇浓度/%毒力回归方程EC50/（mL·L-1）相关系数r

25y=-0.195 4x+5.678 729 756.700.999 942 8

50y=0.118 4x+5.329 60.016 4360.999 449 0

75y=0.378 6x+4.150 31 755.960.999 967 5

100y=-0.081 3x+4.858 30.180 630.999 656 4

综上所述，在果实成熟期核桃青皮甲醇提取物中，50%浓度的核桃青皮甲醇提取物具有最佳的抑菌效果，毒力最强，最高抑制率为80.71%，EC50值为0.016 436。

3" 讨论与结论

根据试验数据的整理与分析可得，乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇4种溶剂的核桃青皮提取物对苹果斑点落叶病菌菌丝生长均具有不同程度的抑制作用，其中以50%甲醇提取的核桃青皮提取物抑制作用最强。不同生长阶段用50%甲醇提取的核桃青皮也有不同程度的抗菌作用。

经查阅文献发现，乔永刚等［6］在核桃青皮提取物对4种植物枯萎病菌的抑菌作用中，比较得出甲醇对于核桃青皮活性物质提取率最高，且甲醇提取物的抑制率高于石油醚提取物的与本试验中结论符合。本研究发现，核桃青皮提取物在抑制真菌活性方面，甲醇提取液效果最显著。与苏学友等［7］的研究结果相符，甲醇提取液对6种植物病原真菌的抑制效果明显优于乙酸乙酯和石油醚提取液。具体而言，甲醇提取液＞乙酸乙酯提取液＞石油醚提取液。

以上试验进一步研究甲醇提取物的不同有机溶剂萃取相分离纯化比较其抑制效果，是本试验需要继续改进研究的方向。

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参考文献

［1］" 王庆云， 史晓晶， 杨福田， 等. 5种杀菌剂对苹果斑点落叶病菌的毒力及田间防效初探［J］. 中国植保导刊， 2023， 43（10）： 78-80，18.

［2］" 樊江斌， 陈林， 冯纪年， 等. 陕西核桃病虫害综合治理研究进展［J］. 陕西林业科技， 2014（6）： 104-107.

［3］" 韩晓云， 刘鹏， 王震， 等. 核桃青皮提取物对病原生物抑菌作用的研究进展［J］. 吉林农业， 2019（5）： 62-63.

［4］" 潘富赟， 张培正. 核桃青皮的综合应用及开发前景［J］. 中国食物与营养， 2010， 135（12）： 21-24.

［5］" 方中达. 植病研究方法［M］. 北京： 中国农业出版社（第3版）， 1998.

［6］" 乔永刚， 牛颜冰. 核桃青皮提取物对4种植物枯萎病菌的抑菌作用［J］. 农学学报， 2011（5）： 9-12.

［7］" 苏学友， 李疆， 师光禄， 等. 核桃青皮提取物对6种植物病原真菌的抑菌活性研究［J］. 北京农学院学报， 2008（1）： 42-44.