乳腺浸润性导管癌超声及超声造影征象与B7-H4表达的相关性

摘要：目的 "分析浸润性导管癌（IDC）超声及超声造影特征与B7同源体4（B7-H4）表达的相关性。方法 "回顾性分析2015年1月～2021年1月在新疆医科大学第一附属医院乳腺外科收治的136例乳腺病变女性患者，手术切除后标本经病理证实为IDC，将病理标本切片并采用免疫组化检测乳腺癌细胞的细胞膜和胞浆中B7-H4表达情况，所有患者术前均行乳腺二维超声检查及超声造影检查并记录病灶超声及超声造影特征，分析IDC超声及超声造影特征与B7-H4表达水平的相关性。结果 "136例患者免疫组化检测B7-H4在乳腺癌细胞的细胞膜和胞浆中均有表达。因抗原修复时温度过高或其他原因导致组织脱片2张，剩余134张切片中，阴性表达6张，阳性表达128张，其中高表达85张，低表达43张。不同的B7-H4表达分组中，B7-H4出现高表达时，IDC二维超声易出现纵横比gt;1、形态不规则、周围组织回声中断，后方回声衰减，淋巴结转移等特征（Plt;0.05）；IDC超声造影易出现增强后病灶内部充盈缺损及增强后病灶周边汇聚征的特征（Plt;0.05）。二维IDC中肿块形态、纵横比、后方声衰减及周围组织回声等二维超声特征与B7-H4的高表达呈正相关（r=0.188、0.240、0.185、0.344，Plt;0.05）。结论 "IDC超声及超声造影表现与B7-H4的表达具有一定相关性，IDC超声及超声造影特征可以预测其分子标志物B7-H4的表达，进而可能为乳腺癌B7-H4靶向治疗效果评估提供可靠的影像学参考依据。

关键词：乳腺浸润性导管癌；B7-H4；超声检查；超声造影

Relationship between ultrasonography and contrast‑enhanced ultrasonography and B7-H4 in breast invasive ductal carcinom

ZHANG Jingyue， HOU Xueqin， YAN Ruiqian， LIU Yibin， LI Zhimin， GAO Junxi

Department of Ultrasound Diagnosis Abdomen， The First Affiliated Hospital， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China

Abstract： Objective To analyze the relationship and correlation between ultrasonography and contrast-enhanced ultrasound features and the expression of B7-H4 in invasive ductal carcinoma （IDC）. Methods A total of 136 female patients admitted to the Department of Breast Surgery， First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from January 2015 to January 2021 were retrospectively analyzed. Following surgical resection， specimens were histopathologically confirmed as IDC. Immunohistochemistry was utilized to detect the expression of B7-H4 in the cell membrane and cytoplasm of breast cancer cells from the pathological specimens. Prior to surgery， all patients underwent two-dimensional ultrasound and contrast-enhanced ultrasound of the breast. Ultrasound and contrast-enhanced ultrasound characteristics of the lesions were documented， and their correlation with the expression level of B7-H4 in IDC was subsequently analyzed. Results The expression of B7-H4 in the cell membrane and cytoplasm of breast cancer cells was detected by immunohistochemistry in 136 patients. Due to the high temperature during antigen repair or other reasons， 2 pieces of tissue were removed. Among the remaining 134 sections， 6 were negative expression and 128 were positive expression， including 85 high expression and 43 low expression. In different B7-H4 expression groups， when B7-H4 was highly expressed， the two-dimensional ultrasound of IDC mass was prone to characteristics such as aspect ratiogt;1， irregular shape， interruption of surrounding tissue echo， posterior echo attenuation， lymph node metastasis （Plt;0.05）; The characteristics of IDC contrast-enhanced ultrasound were prone to the characteristics of internal filling defect and peripheral convergence sign after enhancement （Plt;0.05）. The high expression of B7-H4 was positively correlated with the two-dimensional ultrasound features such as tumor morphology， aspect ratio， posterior acoustic attenuation and surrounding tissue echo in two-dimensional IDC ultrasound （r=0.188， 0.240， 0.185， 0.344， Plt;0.05）. Conclusion IDC ultrasound and contrast-enhanced ultrasound findings have a certain correlation with the expression of B7-H4. The characteristics of IDC ultrasound and contrast-enhanced ultrasound can predict the expression of molecular marker B7-H4 in IDC， and then provide a reliable imaging reference for the evaluation of the possible B7-H4 targeted therapy effect of breast cancer.

Keywords： invasive ductal carcinoma; B7-H4; ultrasonography; contrast-enhanced ultrasound

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，其中浸润性导管癌（IDC）是乳腺癌中最常见的类型［1， 2］。近年来，B7-H4因其在肿瘤免疫逃逸的重要作用而备受关注，B7-H4是一种免疫检查点分子，通过抑制T细胞的增殖、减少白介素（IL）-2、IL-4、IL-10、干扰素（IFN-γ）等细胞因子的产生和控制细胞周期的进程来负性调控T细胞免疫应答［3， 4］。B7-H4在多种癌症中被过度表达，包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌等，其表达水平与肿瘤的侵袭性及患者预后密切相关［5， 6］。特别是在IDC中，B7-H4的高表达与较差的预后相关［7， 8］，这一发现揭示了B7-H4作为潜在治疗靶标的可能性。超声和超声造影作为乳腺癌诊断及治疗效果评估的重要手段，已被广泛应用于临床［9］，目前虽然B7-H4在乳腺癌中的作用已经得到了一定程度的认识［10］，但IDC超声及超声造影特征与B7-H4表达之间是否存在相关性尚未见相关文献报道。本研究探索B7-H4表达与这些超声及超声造影特征之间的关系，有助于深入理解B7-H4在乳腺癌发展中的作用机制，以期为乳腺癌的诊断和治疗策略及效果评估提供新的视角，为乳腺癌有关B7-H4靶向治疗提供较为客观的影像学依据。

1 "资料与方法

1.1 "一般资料

选取2015年1月～2021年1月于新疆医科大学第一附属医院接受乳腺癌手术且术后病理证实为IDC的136例患者临床资料并进行回顾性研究，年龄22～78岁，中位年龄49.5岁。纳入标准：患者均为女性且首次确诊乳腺癌，经病理证实为IDC；未接受任何抗癌处理；具有完整术前超声检查报告以及病理报告。排除标准：术前接受过抗癌治疗；继发性乳腺癌，其他部位癌症转移至乳腺的患者。患者遵循自愿原则，均知情同意并签署研究同意书，对涉及患者隐私的资料保密。本研究获得新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（审批号：K202312-23）。

1.2 "方法

1.2.1 "超声及超声造影检查 " 患者保持仰卧体位，充分显露双侧乳腺及腋窝，采用GE公司 LOGIQ E9 彩超诊断仪，二维超声使用高频探头：ML6-15-D，频率：6～15 MHz。选取乳腺扫查模式，将乳头作为中心，对乳腺的各个切面做放射状、连续性扫描。详细记录结节位置、大小、形态、生长方向（纵横比）、边界、内部回声、周围组织回声及有无微钙化、血流信号、腋窝淋巴结有无转移，血流按照Adler半定量法［11］分为0、I、II、III级。常规超声获得较好的二维图像时，保持探头稳定，选取最佳切面切入造影状态，抽取配置好的5 mL超声造影剂（SonoVue）快速推注入一侧上肢肘静脉，再静推0.9%无菌氯化钠注射液5 mL，注射造影剂后即刻开始记录动态影像，观察约2 min。

超声造影图像分析：增强幅度：肿块增强后与周围正常乳腺组织增强比较（周围正常乳腺组织为等增强）分为高增强（增强后并病变回声明显高于周围正常组织）及其他增强（包括等增强、低增强及无增强）；增强模式：分为快进快退/慢退及其他增强模式（包括慢进快退、慢进慢退、等进快退、等进慢退）；病灶增强后边界是否显示清晰；造影剂进入病灶顺序：分为向心性及非向心性；病灶增强后内部是否存在充盈缺损；病灶增强后内部造影剂分布是否均匀；病灶增强后范围是否扩大；病灶增强后周围是否存在汇聚征。测定结果由2位具有5年以上临床经验的超声科医师在未知病理结果前独立完成分析，有分歧时与第3位高年资医师讨论达成统一意见。

1.2.2 "免疫组化指标的测定及判定标准 " 病理标本病灶常规取材，置10%的福尔马林固定，脱水，石蜡包埋后备用。修整蜡块，4 μm切片，切片置70℃温箱烤片1 h后放于切片盒中，4℃保存备用。切片用二甲苯脱蜡、无水乙醇脱水，用自来水冲洗2 min，再用蒸馏水冲洗3次，每次5 min，滴加200 μL过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，3 min/次，甩去PBS，EDTA高温（98℃）抗原修复后室温冷却，PBS冲洗3次，3 min/次，加血清蛋白封闭，37 ℃孵育40 min并甩去，加兔单克隆抗体B7-H4，按1：1000稀释，4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗3次，5 min/次，甩去PBS，加二抗37 ℃孵育40 min，PBS冲洗3次，3 min/次，加DAB显色，显微镜下观察3～10 min，自来水终止，苏木素复染，盐酸乙醇分化，PBS返蓝，分级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。为消除非特异性染色，用PBS作阴性对照，用已经证实的阳性切片作为阳性对照。

由2位病理医生采用盲法分别对染色切片进行结果判定，采用被广泛接受的德国半定量评分系统［12］。评价染色细胞的染色强度和面积范围。根据细胞染色强度和染色细胞面积定义评分标准（无染色=0；弱染色=1；中度染色=2；强染色=3）和（0%=0；1%～24%=1；25%～49%=2；50%～74%=3；75%～100%=4）。最终得分通过将细胞的染色强度乘以染色细胞的面积来确定，范围从0（最小分级）～12（最高分级）。B7-H4评分为0分为阴性，1～12分为阳性。在阳性标本中，1～8分组为低表达组，9～12分组为高表达组［13］。

1.3 "统计学分析

采用SPSS23.0软件进行统计学分析。计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ²检验或Fisher确切概率法；IDC组织中的B7-H4表达与超声及超声造影征象相关性分析采用Spearman相关性检验。以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 "结果

2.1 "B7-H4在乳腺癌组织中的表达

免疫组化检测B7-H4在乳腺癌细胞的细胞膜和胞浆中均有表达。由于抗原修复时温度过高或其他原因，组织脱片2张，剩余134张切片中，阴性表达6张，阳性表达128张，其中高表达85张，低表达43张。

2.2 "B7-H4分子表达与IDC超声声像图特征之间的关系

B7-H4出现高表达时，IDC肿块二维超声易出现纵横比gt;1、形态不规则、周围组织回声中断、后方回声衰减，淋巴结转移等特征（Plt;0.05，图1，表1），而肿块大小、边界是否清晰、肿块内部是否有微钙化、血流信号分级等与B7-H4表达差异无统计学意义（Pgt;0.05，表1）。

B7-H4出现高表达时，IDC超声造影特征易出现增强后病灶内部充盈缺损及增强后病灶周边汇聚征的特征（Plt;0.05，图2，表2），而病灶增强幅度、增强模式、增强后范围是否扩大、增强后边界是否清晰、造影剂进入病灶顺序、造影剂分布是否均匀等与B7-H4的表达差异无统计学意义（Pgt;0.05，表2）。

2.3 "超声及超声造影特征与IDC组织中B7-H4表达的相关性分析

肿块形态、纵横比、后方声衰减及周围组织回声与B7-H4的表达呈正相关（r=0.188、0.240、0.185、0.344，Plt;0.05，表3）。

3 "讨论

本研究显示，134例IDC切片与分子免疫因子B7-H4免疫组化实验，128张IDC切片均呈阳性表达，并且在阳性表达的切片中，大部分呈现高表达，说明IDC中B7-H4容易出现高表达。当B7-H4出现高表达时，二维超声检查中往往展现出形态不规则、纵横比gt;1及后方声衰减，周围组织改变及腋窝淋巴结转移等特征，这些超声特征往往提示患者可能具有不良预后，这与既往研究显示当出现上述超声特征时，提示乳腺癌往往呈浸润性生长并且更具有侵袭性观点一致［14-17］，肿瘤形态不规则、纵横比gt;1及后方声衰减等特征也往往表明肿瘤处于进展期。此外，B7-H4已被报道与多种肿瘤的进展相关，有研究揭示了B7-H4过表达与胰腺癌淋巴结转移、晚期TNM分期以及胰腺癌患者生存率下降之间的相关性［18］。本研究发现，B7-H4在IDC患者中高表达且与部分二维超声特征呈相关性，分析原因可能为乳腺癌瘤体B7-H4高表达可能改变肿瘤微环境，减少浸润的淋巴细胞总数，特别是细胞毒CD8+T淋巴细胞的总数[19]，从而促进CD8+细胞毒性T细胞（CD8+T细胞）凋亡，诱导T细胞分泌免疫抑制细胞因子转化生长因子（TGF）-β1和IL-17有关［20， 21］。而TGF-β1是一种参与免疫抑制的多功能细胞因子，其高水平表达与患者肿瘤或转移的侵袭性表型显著相关。同时B7-H4可与MHC形成复合体，该复合体所产生的信号可下调IL-2的表达［22］，而IL-2是刺激NK细胞活化和增殖的主要细胞因子，NK细胞具有抗癌活性，可控制肿瘤生长和转移扩散［23］，故B7-H4高表达时，肿瘤生长较快且具有明显侵袭性，从而也更容易出现淋巴结转移扩散，当乳腺癌肿块呈浸润性生长，肿瘤细胞沿着组织间隙向各个方向延伸，原有组织破坏，在二维表现中出现不规则的形态及纵横比增大等特征，同时侵袭性生长的肿块会破坏肿瘤周围库珀韧带发生改变，累及皮肤层淋巴结，致使淋巴管堵塞、皮肤增厚，可在二维超声表现中出现周围组织改变。本研究显示，B7-H4高表达乳腺癌肿块更易出现后方回声衰减，一方面B7-H4呈现高表达时，其增强侵袭性及促进肿瘤生长的作用使肿瘤具有较高的有丝分裂率和较大的细胞密度致使内部结构不均匀，导致了超声波比周围组织更大的衰减有关，另一方面，也与乳腺癌质地硬，肿瘤间质内排列紊乱的胶原纤维成分增多有关［24］。此外，TGF-β1可能通过旁分泌物质增加转移，抑制局部免疫反应或增加血管生成［25］，血管生成是乳腺癌的重要特征，也是癌细胞异常增殖和侵袭的病理基础，它是肿瘤生长、侵袭和转移不可或缺的条件，与多种实体肿瘤的进展密切相关［26， 27］。乳腺癌肿块内部的血供越丰富，就越容易造成对腋窝淋巴系统的侵袭，从而满足肿瘤细胞的高代谢的需要，丰富的滋养血管则成为乳腺癌的肿瘤细胞浸入到皮下淋巴系统的有利因素，新生的肿瘤血管还可以在病灶的周围形成分布广泛而又紊乱的吻合支，为乳腺癌肿块的转移创造了有利条件［28， 29］。而在本研究中，B7-H4的表达高低与二维超声特征中IDC病灶大小、边界是否清晰、肿块内部是否有微钙化、血流信号分级等方面的差异无统计学意义，一方面说明病灶无论B7-H4高表达或低表达，病灶内部均可能会出现微小钙化及血流较丰富等较典型乳腺癌恶性特征，另一方面也可能因为B7-H4的作用受到多种因素影响，包括肿瘤的异质性、个体差异以及其他免疫调节因子的参与等［16， 30］，导致上述超声特征可能无法间接预测B7-H4的表达情况。

本研究中B7-H4呈高表达时，IDC造影特征更易出现增强后病灶内部出现充盈缺损及增强后周边汇聚征。IDC超声造影中出现充盈缺损是由于肿瘤新生血管的形成使得其血流灌注快且丰富，癌组织生长过快导致代谢所需的能量及氧的供应相对不足，造成部分肿瘤组织坏死，从而出现充盈缺损［31， 32］，增强后周边汇聚征的出现往往代表新生肿瘤血管及新生血管数目，B7-H4的高表达促进肿瘤血管生成、生长和侵袭，导致周围放射性分布的新生血管凸显出来而形成汇聚征，是肿瘤侵袭的表现［33］，也进一步说明了乳腺癌肿块B7-H4高表达时肿瘤更具有侵袭性以及生长较迅速，而本研究中IDC肿块超声造影增强幅度、增强模式、增强后范围是否扩大、增强后边界是否清晰、造影剂进入病灶顺序以及造影剂分布是否均匀与B7-H4高低表达差异无统计学意义，说明虽然B7-H4高表达时可能肿瘤更具有侵袭性，但无论肿瘤如何表达B7-H4，乳腺癌肿块超声造影都可能会表现出富血供高增强，快进快退或慢退，增强后范围扩大等特征，这些特征能否作为乳腺癌肿块B7-H4表达的预测依据可能有待未来进一步扩大样本含量进一步进行研究。

综上，在IDC中B7-H4的高表达比较常见，且当其出现高表达时，IDC往往更具有恶性程度高、转移性高、侵袭性强等特征，IDC的部分超声及超声造影特征与B7-H4的表达之间具有相关性，这些特征可预测B7-H4的表达情况，从而为乳腺癌可能的B7-H4靶向治疗效果评估提供可靠的影像学参考依据。

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（编辑：熊一凡）