PCR技术在食品微生物检测中的应用研究

摘 要：PCR技术因具有高灵敏度、高特异性和快速性的特点，在食品微生物检测领域广泛使用。本文阐述食品中常见的致病微生物、PCR技术的基本原理、食品中常见致病微生物的PCR检测方法，探讨PCR技术在食品微生物检测中的应用，并介绍PCR技术在食品微生物检测中的发展趋势。

关键词：PCR技术；食品微生物；致病微生物；实时荧光定量PCR；多重PCR

Study on the Application of PCR Technique in Food Microbiological Detection

WANG Di

（Center for Disease Control and Prevention， Wujin District， Changzhou City， Jiangsu Province，

Changzhou 213100， China）

Abstract： PCR technology is widely used in the field of food microbiological detection because of its high sensitivity， high specificity and rapidity. This paper describes the common pathogenic microorganisms in food， the basic principle of PCR technology， the PCR detection method of common pathogenic microorganisms in food， discusses the application of PCR technology in food microbial detection， and introduces the development trend of PCR technology in food microbial detection.

Keywords： PCR technology; food microorganism; pathogenic microorganism; real-time fluorescence quantitative PCR; multiplex PCR

随着食品工业的快速发展和人们生活水平的不断提高，食品安全问题日益受到政府和公众的高度关注。为保障食品安全、维护公众健康，我国出台了相关政策。食品微生物污染是导致食品安全问题的主要原因之一。传统的食品微生物检测方法，如培养法，存在检测周期长、灵敏度低等缺点。PCR技术以其快速、灵敏、特异等优点，在食品微生物检测领域展现出广阔的应用前景。本文将详细分析PCR技术在食品微生物检测中的原理和应用，探讨其未来发展趋势，为食品安全保障提供新思路和新方法。

1 食品中常见的致病微生物

常见的食品致病微生物有沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌。沙门氏菌属于革兰氏阴性杆菌，通常会导致肠道感染和食物中毒，主要在禽肉、蛋制品等食品中引起污染。李斯特菌是一种革兰氏阳性、兼性厌氧菌，在自然界中广泛分布[1]。这种细菌会引发李斯特菌病，患者的死亡率相对较高。它主要通过污染生鲜食品，如乳制品和肉制品等，传播给人们。大肠杆菌O157：H7是一种致病性细菌，能够分泌志贺毒素，会导致出血性结肠炎和溶血尿毒症综合征。大肠杆菌O157：H7主要污染生牛肉和未经过巴氏杀菌的奶制品等食品。金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性球菌，能够产生肠毒素，主要污染食物包括乳制品和肉制品，可能引起食物中毒。弯曲杆菌是一种革兰氏阴性细菌，属于微需氧或兼性厌氧生物，会导致食源性肠炎和菌血症，主要在禽肉、未经彻底加热的奶制品等食品中引发污染。这些病原微生物经常引起食品安全问题，对人体健康构成威胁。

2 PCR技术概述

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术。它基于DNA的半保留复制原理，通过反复循环的变性、退火、延伸过程，实现目标DNA的指数扩增。PCR反应体系主要包括模板DNA、一对特异性引物、热稳定的DNA聚合酶（如Taq酶）、4种脱氧核苷酸和缓冲液等。PCR反应在特定的温度程序下进行，通常包括94～96 ℃变性、50～65 ℃退火和72 ℃延伸这3个步骤，循环30～40次，每个循环使目标DNA片段呈指数增幅。PCR技术具有快速、高灵敏和高特异的特点，能够迅速扩增微量DNA样本，被广泛运用于基因克隆、疾病诊断和法医鉴定等领域[2]。随着PCR技术的不断进步和创新，包括多重PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR等在内的PCR技术在食品微生物检测领域的应用不断扩大，发挥着关键作用。

3 食品中常见致病微生物的PCR检测方法

PCR检测的关键在于引物和探针的设计、PCR反应条件的优化以及PCR产物的检测和鉴定。引物和探针的设计需要根据目标微生物的特异性基因序列，如毒力基因、致病基因等，利用生物信息学软件进行设计和优化，以提高PCR检测的特异性和灵敏度[3]。PCR反应条件的优化包括反应体系的配制（如DNA聚合酶、镁离子浓度等）、退火温度和时间、循环数等，通过优化PCR反应条件，可提高PCR检测的效率和重现性。PCR产物的检测和鉴定主要采用凝胶电泳、测序、探针杂交等方法，凝胶电泳可根据PCR产物的大小进行定性分析，测序可对PCR产物进行准确鉴定，探针杂交可实现PCR产物的特异性检测。

4 PCR技术在食品微生物检测中的应用

4.1 多重PCR技术在食品微生物检测中的应用

多重PCR技术是利用多对特异性引物，在相同的反应条件下，同时扩增多个目标基因片段，通过优化引物设计和反应条件，可有效避免引物间的相互干扰，提高检测的特异性和灵敏度[4]。与传统的单个PCR技术相比，多重PCR技术可显著提高检测效率，缩短检测时间，降低检测成本，适用于食品中多种致病微生物的同时检测。多重PCR检测食品中多种致病微生物的方法主要包括多重常规PCR和多重实时荧光定量PCR。多重常规PCR技术扩增的多个目标片段可通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和鉴定。利用多重实时荧光定量PCR，可以通过多个荧光标记的特异性探针来同时检测和量化多种致病微生物。例如，通过多重PCR技术，可以同时检测食品中的沙门氏菌、李斯特菌以及大肠杆菌O157：H7等多种致病菌。

4.2 实时荧光定量PCR技术在食品微生物检测中的应用

随着PCR反应的进行，荧光信号强度不断积累，通过实时监测荧光信号的变化，可获得PCR产物的动态积累曲线，从而实现目标微生物的定量分析。与传统的PCR检测相比，实时荧光定量PCR具有更高的灵敏度、特异性和重现性，可实现目标微生物的绝对定量和相对定量，避免了PCR后处理的交叉污染风险[5]。在食品微生物定量检测中，实时荧光定量PCR技术能够精确测量食品中致病微生物的数量，评估食品的微生物安全风险，并指导制定食品安全管理和控制措施。例如，通过实时荧光定量PCR技术，可以迅速而准确地检测食品中沙门氏菌、李斯特菌等病原菌的污染水平，从而为评估食品安全风险提供重要参考依据。

4.3 数字PCR技术在食品微生物检测中的应用

数字PCR技术是将待测样品与PCR反应液混合，通过微流控芯片或油包水乳液将其分隔为大量独立的微反应腔，每个反应腔作为一个独立的PCR反应单元。经过PCR扩增后，根据各反应腔的荧光信号，可判断每个反应腔中是否含有目标微生物的DNA模板，并统计阳性反应腔的数量，通过泊松分布计算得到待测样品中目标微生物的绝对含量[6]。与传统的实时荧光定量PCR相比，数字PCR无须标准曲线，可直接实现目标微生物的绝对定量，具有更高的灵敏度、准确性和重现性，特别适用于低拷贝数模板的定量分析。在食品微生物检测中，数字PCR技术可精确定量食品中致病微生物的含量，即使在复杂基质和低污染水平下也能实现准确定量。例如，数字PCR技术可以在食品样品中高效地检测出沙门氏菌、李斯特菌等病原微生物，为评估和控制食品安全风险提供了可靠的手段。数字PCR技术的高灵敏度、准确性和重现性使其成为食品微生物定量检测的新选择。

4.4 PCR技术与其他检测技术联用在食品微生物检测中的应用

PCR-ELISA技术是一种结合了PCR扩增和ELISA检测的方法，它利用特异性探针与PCR产物结合，并通过酶标记进行反应，从而产生可测量的信号，以实现对目标微生物的特异性检测和定量分析。PCR-ELISA技术是一种比单独使用PCR或ELISA更具敏感性和特异性的检测方法，尤其适用于食品中低浓度致病微生物的检测[7]。PCR-生物芯片技术是将PCR扩增和DNA微阵列芯片相结合，利用PCR扩增来富集目标微生物的核酸，然后利用芯片上固定的多种特异性探针进行杂交和检测，从而实现对食品中多种致病微生物的同时检测和鉴定。PCR-质谱技术是将PCR扩增和质谱分析相结合的一种方法。它首先使用PCR扩增特定微生物的核酸片段，然后利用MALDI-TOF-MS对PCR产物进行精确的分子量测定和序列分析。该技术可以快速、准确地鉴定食品中的致病微生物。将PCR技术与ELISA、生物芯片和质谱等技术结合起来，能够充分发挥各种技术的优势，为食品微生物的高灵敏、多重和快速检测提供了新的解决方案。这种联合运用在食品安全监测和风险控制领域具有广阔的应用前景。

5 PCR技术在食品微生物检测中的发展趋势

PCR技术在食品微生物检测中的发展趋势主要体现在4个方面。①自动化、微型化和便携化。利用微流控芯片技术和集成化技术，实现样品制备、扩增反应和产物检测等步骤的自动化和一体化，同时结合无线传输技术，实现检测数据的实时传输和远程监控[8]。②多重化和高通量化。多重PCR技术可在单个反应中同时检测多种目标微生物，高通量PCR检测平台可同时处理数十至数百个样品，极大地提高了检测通量和效率。③定量化和数字化。实时荧光定量PCR和数字PCR技术可实现目标微生物的准确定量，为食品安全风险评估提供更加丰富和可靠的数据支持。④与其他检测技术的联用。将PCR技术与培养法、免疫学方法、生物传感器等技术联用，可发挥各种技术的优势，实现食品微生物检测的全流程优化和综合效能提升，为食品安全和公众健康提供更加全面、可靠、高效的保障[9]。

6 结语

PCR技术在食品微生物检测中扮演着关键的角色，主要因其具备高度敏感性、特异性和快速性等优点。近年来，一系列新型PCR技术相继推出，其中包括多重PCR、实时荧光定量PCR和数字PCR等。这些技术的出现进一步增强了对食品中病原微生物的检测效能和准确性。将PCR技术、ELISA、生物芯片和质谱等多种技术相结合，可以为食品微生物的全面分析提供全新的研究方向。未来，食品微生物检测领域将迎来PCR技术的自动化、微型化、便携化、多重化、高通量化、定量化和数字化发展趋势。这一技术将与其他检测方法相结合，为食品微生物检测提供更快速、更灵敏、更准确和更经济的解决方案。随着PCR技术的不断发展和完善，它将在食品安全保障体系中扮演日益重要的角色，为维护人们健康提供更加有力的支持。

参考文献

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