补骨脂种子提取物对茶饼病菌的抑菌活性

2024-06-25孙礼雪关丽杰马晓彤高洁张洪雨商今雨

湖北农业科学 2024年5期

孙礼雪关丽杰马晓彤高洁张洪雨商今雨

摘要：探讨补骨脂（Psoralea corylifolia L.）种子提取物对茶饼病菌（Exobasidium vexans Massee）的抑菌活性及田间防治效果。采用孢子萌发抑制率法和菌丝生长速率法测定补骨脂种子提取物的抑菌活性，按照农药田间药效试验准则在5省5地进行茶饼病田间试验。室内抑菌活性试验结果表明，补骨脂种子提取物对茶饼病菌孢子萌发和菌丝生长具有明显的抑制作用，抑制率随着药剂浓度的增加而增加，其EC50分别为12.925 mg/L和6.074 mg/L。田间试验结果表明，当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.00～2.67 mg/kg时，其对茶饼病的防治效果为68.08%～83.78%，其防治效果相当或优于对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂。

关键词：生物农药；茶饼病菌（Exobasidium vexans Massee）；抑菌活性；田间防治效果；补骨脂（Psoralea corylifolia L.）种子提取物

中图分类号：S432；S435.711 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0050-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.009 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

The antifungal activity of Psoralea corylifolia seeds extract against Exobasidium vexans

SUN Li-xue1， GUAN Li-jie1， MA Xiao-tong2， GAO Jie1， ZHANG Hong-yu1， SHANG Jin-yu1

（1.School of Pharmaceutical and Bioengineering， Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142，China；

2.Chaoyang Yanwangbizi Reservoir Construction Administration， Chaoyang 122099，Liaoning，China）

Abstract： The antifungal activity and the field control effects of Psoralea corylifolia seeds extract against Exobasidium vexans were explored. The spore germination inhibition rate method and mycelium growth rate method were used to determine the antifungal activity of Psoralea corylifolia seeds extract， and the field trials of Exobasidium vexans were carried out in five provinces and five places according to the pesticide field efficacy trials guideline. The indoor antifungal activity test showed that Psoralea corylifolia seeds extract had an obvious inhibitory effect on the spore germination and mycelium growth of Exobasidium vexans， and the inhibition rate increased with the increase of drug concentration， with the EC50 of 12.925 mg/L and 6.074 mg/L， respectively. The results of field trials showed that when the dosage of active ingredients of Psoralea corylifolia seeds extract microemulsion was 2.00～2.67 mg/kg， the field control effects of Exobasidium vexans was 68.08%～83.78%， which was equivalent to or better than that of the control agent 3% polyoxin wettable powder.

Key words： biological pesticide； tea cake disease（Exobasidium vexans Massee）； antifungal activity； field control effects； Psoralea corylifolia seeds extract

收稿日期：2023-04-23

基金项目：国家重点研发计划项目（SQ2020YFF0411744）；辽宁省教育厅项目（LJKMZ20220787）

作者简介：孙礼雪（1997-），女，辽宁大连人，在读硕士研究生，研究方向为生物农药与生物技术，（电话）17824252854（电子信箱）

2322911311@qq.com；通信作者，关丽杰（1968-），女，辽宁沈阳人，副教授，博士，主要从事生物农药与生物技术研究，

（电话）13840081801（电子信箱）guanlijie6868@syuct.edu.cn。

孙礼雪，关丽杰，马晓彤，等. 补骨脂种子提取物对茶饼病菌的抑菌活性［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：50-55．

茶饼病菌（Exobasidium vexans Massee）［1-4］是由外担子菌引起的真菌性病害，这种病原菌攻击茶树的嫩叶，导致茶树病叶所制成的干茶易碎且滋味异常苦涩、茶叶色泽昏暗，品质下降［5，6］。同时，中国每年由于茶饼病而导致的减产可达20%～30%［7］。

在生产中通过选育和种植抗病品种［8-10］、强化对茶园的栽培管理［11，12］以及喷施药剂等措施防治茶饼病，其中药剂喷施是最有效的方法之一。梁碧元等［13］进行了8种杀菌剂防治茶树茶饼病的田间试验，结果表明8种杀菌剂均可提高对茶饼病的防治效果，能稳定控制病斑，使病叶率下降。其中53.80%氢氧化铜（可杀得）1 100倍稀释液、25%吡唑嘧菌酯（凯润）1 560倍稀释液、15%三唑酮1 650倍稀释液对茶饼病的防治效果较好，2次施药后防治效果分别为88.14%、84.75%、83.05%。使用化学药剂，农药易残留、不易降解，对环境和茶叶品质影响较大，致使茶叶出口困难，故化学药剂的使用受到制约［14，15］。生物药剂由于具有无污染、无公害、易降解、不易产生抗药性等特点越来越受到重视。市面上防治茶饼病的生物药剂有多抗霉素可湿性粉剂、蛇床子素水乳剂、波尔多液可湿性粉剂、丁子香酚可溶液剂、井岗·蜡芽菌水剂、大黄素甲醚水剂以及氨基寡糖素，其中使用最多的是多抗霉素可湿性粉剂。陈德西等［16］进行了6种生物农药的田间试验，结果表明10%多抗霉素B对茶饼病的防治效果最好，可达98.39%。李向阳等［17］通过试验筛选对高海拔茶树茶饼病防治效果较好的生物药剂，结果表明10%多抗霉素对贵州省遵义市湄潭县和铜仁市德江县高海拔区茶饼病的防治效果分别为62.43%、58.17%，与5%氨基寡糖素混配后防治效果显著提升，分别达67.30%、72.77%，二者混配后可用于高海拔茶区茶饼病的防治。

补骨脂（Psoralea corylifolia L.）种子提取物微乳剂［18，19］是一种植物源杀菌剂，其有效成分来源于豆科植物补骨脂。在农业方面，其可以有效防治多种病害，如苹果腐烂病［20］、水稻稻瘟病［21］、黄瓜细菌性角斑病［22］等。本研究通过室内抑菌活性试验测定了补骨脂种子提取物对茶饼病菌的抑菌活性，按照农药田间药效试验准则GB/T 17980.82—2004在广东省广州市、安徽省六安市、湖南省张家界市、重庆市合川区、湖北省利川市开展防治茶饼病的田间药效试验，为其在茶树上的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种茶饼病菌（Exobasidium vexans Massee）分离自福建省政和县大红村福安大白。

1.1.2 仪器与试剂

1）仪器。生化培养箱（SPX-250B-Z型）、立式压力蒸汽灭菌锅（BXM-30R型），上海博迅实业有限公司医疗设备厂；单人净化工作台（SW-CJ-IG型），苏州净化仪器有限公司；SCOUT电子天平（SCA210型），臾豪斯国际贸易有限公司；振荡培养箱（TSQ-280型），上海精宏试验设备有限公司；生物显微镜（CX33型），济南来宝医疗器械有限公司。

2）试剂。补骨脂种子提取物（含2%苯丙烯菌酮），补骨脂种子提取物微乳剂（含0.2%苯丙烯菌酮），沈阳同祥生物农药有限公司；多抗霉素原药（31.5%）、3%多抗霉素可湿性粉剂，山东鲁抗生物农药有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 孢子萌发试验从茶饼病菌平板上切取菌饼，用接种针将菌块移植于PDA平板中央，置于恒温培养箱中培养。25 ℃条件下培养30 d后，向茶饼病菌平板中加入无菌葡萄糖水（含2%的葡萄糖） 5 mL，用毛刷沿着同一方向轻轻刷洗茶饼病菌平板表面，再经4层纱布过滤，得到浓度为1×105～1×106个/mL的孢子悬浮液。

用溶剂丙酮将补骨脂种子提取物溶解，配制成浓度为10、30、90、270、810 mg/L的溶液，分别取上述药液10 μL和孢子悬浮液190 μL置于24微孔板中，致使药剂终浓度分别为0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 mg/L，每处理重复3次，以CK与多抗霉素原药作为对照。将上述处理置于恒温培养箱中培养，以萌发芽管长度为茶饼病菌孢子直径的1/2时视为萌发。当空白组的孢子萌发率达90%以上时，每处理随机选取200个孢子，统计孢子萌发数目并计算萌发抑制率。

孢子萌发抑制率=[对照孢子萌发率-处理孢子萌发率对照孢子萌发率×]100% （1）

1.2.2 抑菌活性试验用丙酮将补骨脂种子提取物完全溶解后，取适量加入PDA培养基中，充分摇匀，配制成终浓度为10、30、90、270、810 mg/L的含药培养基，以无菌水、多抗霉素原药加入培养基中作为对照，然后倒入玻璃培养皿内冷却、凝固，备用。

用打孔器从长势良好的茶饼病菌平板上切取菌饼，并转接于各处理、对照平板中央，每个处理重复5次，置于25 ℃恒温培养箱中培养5～7 d，用直尺测量菌落直径。采用相交垂直线法测量菌落直径，以其均值减去菌饼直径即得菌落生长的净直径。

抑制率=[对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径]×100%

（2）

1.2.3 田间防治效果试验

1）供试作物位置及环境条件。广东省广州市试验地位于增城区宁西镇冯村华南农业大学试验基地茶园，土质壤土，有机质含量高。试验地栽培条件均匀一致，管理水平高，长势较好。

安徽省六安市试验地位于霍山县漫水河镇平田村，在山地地区，茶树树龄10年，土质沙壤土，肥力中等。茶园雨量充沛，排水方便。2021年3月24日施尿素240 kg/hm2作为春茶肥，2021年7月10日施复合肥180 kg/hm2，定期进行人工除草。

湖南省张家界市试验地位于桑植县八大公山镇马龙山村，试验田面积为667 m2，土质为黄壤土，土壤pH为6.2，土壤有机质含量为3.5%。

重庆市合川区试验地位于盐井镇，土质壤土，pH为6.1。水分充足，肥力均匀，常年修剪。茶园管理较好，栽培规范，密度合理，杂草拔除及时。

湖北省利川市试验地位于凉雾村，海拔800 m左右，多雾天气多，历年茶树茶饼病发生较重。土质为黄壤土，土壤pH为7.1，有机质含量为1.6%。

上述各试验点施药前经随机调查无其他病害或明显虫害。试验开始至试验结束，未施用其他防治茶饼病药剂。按照茶树生产相关规定进行管理，各地处理一致，茶树长势一致。

2）供试药剂及处理。共设4个处理，补骨脂种子提取物微乳剂（1.33、2.00、2.67 mg/kg），3%多抗霉素可湿性粉剂（100.00 mg/kg），以清水为对照（CK），具体药剂用量见表1。

3）小区安排。分别在广东省广州市、安徽省六安市、重庆市合川区、湖北省利川市试验地划分4个区组，共20个小区，每小区20 m2，随机区组排列。试验设5个处理，每个处理设4次重复。湖南省张家界市试验地划分为4个区组，共20个小区，每小区15 m2，随机区组排列。试验设5个处理，每个处理设4次重复。小区间设隔离区，试验田四周设保护行。

4）施药方法。对水喷雾，使用背负式喷雾器进行药物喷施。于茶树茶饼病发生初期进行第一次施药，共施药3次，施药间隔为7～10 d，试验药剂用水量900 L/hm2。按照试验剂量，以试验小区为单位配制药液、施药。从小区一侧开始施药，由低浓度到高浓度向小区匀速喷雾，不重喷、漏喷，保持喷幅及喷洒高度一致，以叶片药液不滴落为宜。

5）调查方法。参考农药田间药效试验准则GB/T 17980.82—2004《杀菌剂防治茶饼病》。每小区随机选取新梢下第3片叶，调查50～100片叶，记录调查的总叶数、各级病叶数。

分级方法：0级，无病斑；1级，每片叶有病斑5个以下；3级，每片叶有病斑6～10个；5级，每片叶有病斑11～15个；7级，每片叶有病斑16～20个；9级，每片叶有病斑21个以上。

6）药效计算方法。采用Excel软件和邓肯法（DMRT）对数据进行分析，并用SPSS软件协助完成统计分析。病情指数按式（3）计算。

病情指数=[各级病叶数×相对级数值调查总叶数×9×100]

（3）

防治效果按式（4）计算。

防治效果=[1-CK0×PT1CK1×PT0×]100% （4）

式中，CK0为空白对照区施药前病情指数；CK1为空白对照区施药后病情指数；PT0为药剂处理区施药前病情指数；PT1为药剂处理区施药后病情指数。

2 结果与分析

2.1 不同药剂对茶饼病菌孢子萌发的抑制活性

采用孢子萌发抑制率法测定不同浓度补骨脂种子提取物对茶饼病菌孢子萌发的抑制活性。由表2可知，随着补骨脂种子提取物浓度的增加，对茶饼病菌孢子萌发的抑制活性逐渐增加。当药物浓度为0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 mg/L时，抑制率分别为47.37%、76.84%、85.26%、90.00%、93.16%，EC50为6.074 mg/L。当多抗霉素原药浓度为5.0 mg/L时，抑制率为37.37%，说明补骨脂种子提取物对茶饼病菌孢子萌发具有较强的抑制作用。

2.2 不同药剂对茶饼病菌菌丝生长的抑制活性

采用菌丝生长速率法，测定补骨脂种子提取物对茶饼病菌的抑制活性。由表3可知，当药物浓度为10、30、90、270、810 mg/L时，对茶饼病菌菌丝生长的抑制率分别为50.25%、53.40%、66.67%、71.97%、81.09%。补骨脂种子提取物对茶饼病菌的抑菌率随着药剂浓度的增加而增加，EC50为12.925 mg/L。当多抗霉素原药浓度为100 mg/L时，抑制率为55.89%，由此可知补骨脂种子提取物对茶饼病菌具有很好的抑制作用。

2.3 不同药剂对茶饼病的田间防治效果

2.3.1 田间试验结果广东省广州市的试验结果（表4）表明，补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.67 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为67.74%、74.79%、79.81%，药剂防治效果随施药次数的增加而提高；当有效成分用量为2.00 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为63.61%、67.56%、74.27%；当有效成分用量为1.33 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为59.36%、64.13%、66.74%；对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂3次施药后防治效果分别为63.01%、67.35%、74.64%。

差异显著性结果表明，第三次施药后7 d，不同浓度的补骨脂种子提取物微乳剂处理间的防治效果差异显著。补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.67 mg/kg处理的防治效果显著优于对照药剂；补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.00 mg/kg处理的防治效果与对照药剂相当，二者之间无显著差异。故供试药剂有效成分用量为2.00～2.67 mg/kg时对茶饼病的防治效果较好。

安徽省六安市的田间试验结果（表5）表明，补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.67 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为74.90%、76.84%、80.78%；当有效成分用量为2.00 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为70.92%、73.54%、75.54%；当有效成分用量为1.33 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为64.49%、68.17%、71.21%；对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂3次施药后防治效果分别为70.14%、73.86%、76.50%。

差异显著性结果表明，第三次施药后14 d，补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.67 mg/kg处理的防治效果显著优于有效成分用量2.00 mg/kg。与对照药剂相比，补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.67mg/kg处理的防治效果优于对照药剂，但二者之间无显著差异。补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.00 mg/kg处理的防治效果与对照药剂相当，二者之间无显著差异。故供试药剂有效成分用量为2.00～2.67 mg/kg时对茶饼病的防治效果较好。

湖南省张家界市的田间试验结果（表6）表明，补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.67 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为25.00%、61.49%、72.61%；当有效成分用量为2.00 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为18.98%、51.60%、66.58%；当有效成分用量为1.33 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为13.64%、43.74%、60.22%；对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂3次施药后防治效果分别为21.90%、54.46%、70.33%。

差异显著性结果表明，第三次施药后7 d，补骨脂种子提取物微乳剂不同浓度处理间的防治效果差异显著。与对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂相比，补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.67 mg/kg处理的防治效果优于对照药剂，但二者在第一次、第三次施药后无显著差异。补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.00 mg/kg处理的防治效果低于对照药剂，且差异显著。表明当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.67 mg/kg时对茶饼病的防效较好。

重庆市合川区的田间试验结果（表7）表明，当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.67 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为68.60%、78.06%、83.78%；当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.00 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为61.58%、70.70%、78.34%；当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为1.33 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为58.19%、66.29%、74.06%；对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂3次施药后防治效果分别为61.79%、71.73%、77.41%。

差异显著性结果表明，第三次施药后10 d，补骨脂种子提取物微乳剂不同浓度处理间的防治效果差异显著。与对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂相比，补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.67 mg/kg处理的防治效果显著优于对照药剂，有效成分用量2 mg/kg处理的防治效果与对照药剂相当，无显著差异。故当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.00～2.67mg/kg时对茶饼病的防治效果较好。

湖北省利川市的田间试验结果（表8）表明，当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.67 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为49.14%、57.12%、68.08%；当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.00 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为45.87%、54.73%、62.27%；当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为1.33 mg/kg时，3次施药后防治效果分别为41.24%、50.40%、56.79%；对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂3次施药后防治效果分别为46.57%、56.46%、65.81%。

差异显著性结果表明，第三次施药后10 d，补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.67 mg/kg处理的防治效果优于对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂，但二者之间无显著差异；补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量2.00 mg/kg处理的防治效果与对照药剂相当，且二者之间无显著差异。故当补骨脂种子提取物微乳剂有效成分用量为2.00～2.67 mg/kg时对茶饼病的防治效果较好。

2.3.2 安全性调查补骨脂种子提取物微乳剂在推荐使用剂量范围内施用，茶树植株、叶片未见明显畸形或黄化等现象，说明补骨脂种子提取物微乳剂对茶树没有产生药害，试验期间也未发现该药剂对其他生物有明显的影响。

3 小结与讨论

茶饼病是茶树的严重病害之一，常用防治茶饼病的方法大多以化学药剂为主，使用化学药剂农药易残留、不易降解、对环境和人畜影响较大、易产生药害等。而植物源农药由于具有无污染、无公害、易降解、不易产生抗药性等特点越来越受到重视。本试验采用室内抑菌活性试验，测定补骨脂种子提取物对茶饼病菌的抑菌活性，并通过田间试验验证防治效果。

茶饼病菌室内抑菌活性试验表明，补骨脂种子提取物对茶饼病菌菌丝生长和孢子萌发具有较强的抑制作用。在一定浓度范围（10～810 mg/L）内，其抑制率随着药物浓度的增加而增加，EC50分别为12.925 mg/L和6.074 mg/L。

田间试验结果表明，补骨脂种子提取物微乳剂可以有效防治茶树茶饼病。补骨脂种子提取物微乳剂推荐有效成分用量为2.00～2.67 mg/kg，对茶树茶饼病的防治效果相当或优于对照药剂3%多抗霉素可湿性粉剂，防治效果可达68.08%～83.78%。补骨脂种子提取物微乳剂在制剂用量范围（10～810 mg/L）内对茶树安全，于茶树茶饼病发病初期开始施药，共施药3次，间隔7～14 d。此外，对于施药次数和间隔天数可视茶饼病发生时期和发展程度等具体情况灵活调整。

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